1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CITOGENÉTICA PROTOCOLOS DE CITOGENÉTICA VEGETAL Dra. Creucí Maria Caetano Profesora Asociada Universidad Nacional de Colombia sede Palmira Grupo de Investigación em Recursos Fitogenéticos Neotropicales - GIRFIN Colaboradores Martha Lucia Escandon, MSc., GIRFIN Richard Danilo Peña, I. Agrónomo, GIRFIN Yuri Marcela Garzón, Bióloga, GIRFIN Palmira, Colombia 2016 1
2 PROTOCOLOS DE CITOGENÉTICA VEGETAL Dra. Creucí Maria Caetano Profesora Asociada Universidad Nacional de Colombia sede Palmira Grupo de Investigación em Recursos Fitogenéticos Neotropicales - GIRFIN Colaboradores Martha Lucia Escandon, MSc., GIRFIN Richard Danilo Peña, I. Agrónomo, GIRFIN Yuri Marcela Garzón, Bióloga, GIRFIN Palmira, Colombia 2016 2
3 CONTENIDO Presentación 1 Mitosis: generalidades 2 Protocolo convencional para preparación de láminas de mitosis para tinción no diferencial en plantas 2.1 Obtención y colecta del material para análisis cromosómicos 2.2 Pretratamiento 2.3 Fijación y almacenaje del material 2.4 Tratamiento (hidrólisis) enzimático y ácido 2.5 Montaje de láminas 2.6 Selección de la técnica y del colorante para tinción 3 Mitosis en raíz de cebolla (Allium cepa): tinción con orceína acética 4 Cromosomas mitóticos de plantas: tinción con hematoxilina 5 Cromosomas mitóticos de plantas: tinción con Giemsa 6 Mitosis en raíz de cebolla (Allium cepa): método de Feulgen (según M. Guerra) 7 Mitosis en raíz de ajo (Allium sativum): método de Feulgen (según A. García Velásquez) 8 Protocolo convencional para preparación de láminas de mitosis con tinción diferencial en plantas 8.1 Bandeo NOR:observación del nucléolo y NOR 8.2 Bandeo C-Giemsa 8.3 Técnica de fluorocromos para estudio cariotípico: doble tinción con CMA y DAPI 8.4 Técnica de fluorocromos para estudio cariotípico: triple tinción y contra-tinción 8.5 Técnica de fluorocromos para estudio cariotípico: tinción con Hoechst 33258, Quinacrina o Iodeto de Propideo 9 Núcleo interfásico: significado evolutivo 10 Determinación del número cromosómico y análisis del cariotipo 3
4 11 Meiosis: generalidades 12 Protocolo convencional para preparación de láminas para análisis de cromosomas meióticos 12.1 Técnicas de tinción seguida de aplastamiento 12.2 Técnicas de aplastamiento seguido de tinción 13 Meiosis, fertilidad y número cromosómico en el polen de Rhoeo discolor: coloración con orceína propiónica al 2% 14 Análisis de células del tapetum y de la mitosis polínica 15 Nociones de palinología 16 Métodos de estimación del número de polen 17 Apomixis 18 Meiosis en inflorescencia masculina de maíz (Zea mays): coloración con carmín acético o propiónico al 1% 19 Tétradas de microsporas: patrones e importancia evolutiva 20 Variación cariotípica y evolucion del genoma variaciones cromosómicas numéricas 21 variación cariotípica y evolucion de genoma variaciones cromosómicas estructurales 22 Preparo de soluciones más utilizadas en Citogenética Vegetal 23 Organización del laboratorio de Citogenética Vegetal Referencias bibliográficas 4
5 PRESENTACIÓN Una vez propuesta la Teoría de la Herencia Cromosómica, al inicio del siglo XX, los conocimientos de la Citología y la Genética fueron superpuestos en un área común denominada Citogenética. La Citogenética es una ciencia de investigación, de naturaleza teórico-práctica, que tiene por objeto el estudio de los aspectos genéticos observables mediante la microscopia. Comprende el estudio de la diversidad y la variabilidad genética, a través de técnicas para análisis de los genomas en distintos niveles de complejidad, lo que sirve para la caracterización de una especie, especialmente si se adicionan datos morfológicos y biogeográficos. Así, el cromosoma es la unidad fundamental de estudio de esta ciencia híbrida. Según Guerra (1988), la Citogenética comprende todo y cualquier estudio relacionado al cromosoma aislado o en conjunto, condensado o extendido, en lo que respecta su morfología, organización, función y replicación, además de su variación y aspectos evolutivos. Los análisis citogenéticos incluyen la evaluación del comportamiento cromosómico durante la meiosis y la caracterización del cariotipo (número y morfología de los cromosomas y la posición del centrómero; localización y caracterización de la heterocromatina constitutiva; aspecto del núcleo interfásico, y número y posición de las regiones organizadoras del nucleolo) especialmente en la mitosis. Esto posibilita distinguir características derivadas o exclusivas de cada especie y básicas o comunes a todas o a la mayor parte de ellas. Útil para programas de mejoramiento, introgresión de 5
6 caracteres agronómicos deseables y formación de híbridos viables. Problemas relacionados a la posición sistemática también pueden ser resueltos. Con estudios citotaxonómicos se traza o se recontruye la filogenia de especies domesticadas o de uso potencial. El cariotipo es una característica mucho más propia de la especie, prácticamente insensible a las variaciones ambientales o fisiológicas, al contrario de los parámetros morfológicos y bioquímicos. Junto al contenido de ADN y al número de cromosomas satelitados, permite estudios seguros de especies o grupos. Por lo tanto, la Citogenética aporta a otras áreas como la Taxonomía (Citotaxonomía), Bioquímica, Medicina, Evolución, Mejoramiento Genético, Biotecnología, y a la caracterización de los recursos genéticos o de la diversidad biológica. El presente Protocolos de Citogenética Vegetal ha resultado de la aplicación de esa ciencia a lo largo de mas de una década, en laboratorios de experimentación y académicos. Empezando por las soluciones más empleadas en la Citogenética Vegetal contiene, de forma sencilla, una fundamentación teórica resumida de los conceptos básicos de la Citogenética y sus aplicaciones (aquí se encuentran la preparación de los colorantes y reactivos utilizados en cada técnica). Además, un listado de los materiales y equipos básicos para desarrollar esa ciencia y una explicación de como registrar y organizar datos resultantes de la investigación citogenética en vegetales. También será abordado en Protocolos temas sobre el polen, un marcador genético de alta confiabilidad, por ser especieespecífico. Sus estudios, asociados a los datos de la Citogenética, contribuyen para caracterizar una especie y discriminar especímenes entre y dentro de grupos. Se 6
7 mostrarán los principales descriptores para caracterización polínica y las técnicas para su estudio, en microscopia óptica (MO). Esperamos que este Protocolo le sea útil en sus incursiones por la fascinante ciencia de la Citogenética. 7
8 1 MITOSIS: GENERALIDADES Los eucariotos presentan, entre sus características principales, tipos de división celular que propician el aumento en número de individuos (en los unicelulares) o de células (en un organismo pluricelular), denominada mitosis, o la continuidad de la especie y transmisión de sus caracteres heredables, a través de los cromosomas contenidos en las células sexuales o gaméticas, por medio de la meiosis. La diferencia básica entre esos dos tipos de división celular es que la mitosis ocurre en una célula somática, diploide (2n), luego de la replicación del ADN, resultando en dos células hijas exactamente iguales a la célula madre, tambén diploides, mientras la meiosis consiste en dos divisiones celulares sucesivas (meiosis I y meiosis II), a partir de una célula germinativa 2n, resultando en cuatro células haploides (n), los productos finales de la meiosis. La mitosis es por lo tanto conservativa, mientras la meiosis es una división reducional, además de ocurrir en esta la recombinación génica. El ciclo celular en una división mitótica comprende las siguientes fases, de acuerdo con Singh (2003): interfase; profase; prometafase; metafase; anafase; telofase y citocinesis (Figura 1-1). La interfase corresponde a un estadio largo y de intensa actividad metabólica de la célula, donde se verifica la replicación del ADN y la activación de la maquinaria para el proceso de división celular. La cromatina se presenta una parte condensada, formando los cromocentros, y la otra 8
9 descondensada, reconocida por cromatina difusa. Presenta tres periodos, G 1, S de síntesis del ADN, y G 2 ). La duración mínima del ciclo celular depende de S, generalmente el más largo. G 1 (gap = intervalo) presenta duración variable, siendo el más influenciado por el medio. En G 1 cada cromosoma está constituido por una cromátida, mientras en G 2, debido a la replicación, presenta dos cromátidas. Por lo tanto en G 2 el contenido de ADN es el doble que en G 1. El contenido (= content, C) o cantidad de ADN se expresa en picogramas (pg) o en pares de nucleótidos o bases (pb). Un pg es igual a 10-12 g y equivale a 9.5 x 10 8 pb. El gameto, siendo haploide, contiene 1C de ADN. Una célula somática, diploide, contiene 2C en G 1 y 4C en G 2. Durante la interfase el nucléolo (sede de la síntesis de ARN ribosomal) es visible. La profase es la fase de más larga duración, donde los filamentos cromosómicos (cromonemas) por condensación forman los cromosomas metafásicos, para que facilite la equipartición del material genético entre las dos células hijas. Al final de la profase se desintegran el nucléolo y la membrana nuclear, mientras algunas fibrilas del huso se ligan al cinetocoro de cada cromosoma. La prometafase corresponde a la transición profase-metafase, con los cromosomas ya bien condensados y dispuestos por el núcleo, dirigiéndose al ecuador (plan mediano) de la célula. En la metafase los cromosomas están alineados en la placa ecuatorial o metafásica. Esta es la mejor fase para visualización 9
10 y conteo de los cromosomas, en especial si se hace un pretratamiento con un inhibidor de huso (antimitótico), el cual se liga a las proteínas que conforman las fibras del huso, las tubulinas, impediendo su polimerización e inactivando su acción. Estas células se denominan c-metafases (c-, por el alcaloide antimitótico colchicina). En la anafase los centrómeros de cada cromosoma se dividen, separando las cromátidas hermanas, que migran hacia los polos de la célula. La separación de los cromosomas se debe a la despolimerización de las fibras del huso que parten del cinetocoro hacia uno de los polos de la célula, además del alargamiento de las fibras que surgen entre los cinetocoros hermanos. En telofase, el inverso de la profase, los cromosomas no individualizados ya conforman dos núcleos pequeños y densos, los cuales se agrandan por los cromocentros y la cromatina difusa. El nucléolo y la membrana nuclear se reorganizan, mientras el huso y la estructura cromonema se tornan invisibles. La división celular culmina con la citocinesis (Figura 1-1), que consiste en la bipartición en dos células hijas, cada una con el mismo número de cromosomas 2n de la especie. En vegetales, el acúmulo de vesículas producidas por el aparato de Golgi, más microfibrilas, dan origen al fragmoplasto, inicio de la formación de la pared celular. 10