1.1. MICROSCÓPIO ÓPTICO

Transcripción

1 PRÁCTICA 1: 1.1. MICROSCÓPIO ÓPTICO Introducción: La observación de las estructuras biológicas es difícil porque son generalmente de pequeño tamaño y suelen ser transparentes a la luz visible. Estas dos propiedades físicas han sido decisivas para el desarrollo de nuevos instrumentos diseñados con el fin de proporcionar una mejor definición de las estructuras biológicas, aumentando por un lado el poder resolutivo y contrarrestando por otra parte la posible transparencia mediante el aumento de contraste. Según el principio en que se funda la amplificación de la imagen los microscopios se clasifican en: Ópticos (luz): Campo claro, campo oscuro, ultravioleta, luz polarizada, contraste de fase, etc. Electrónicos (haz de electrones). Se necesitan microscopios más complicados para la investigación; por ello existen los microscopios electrónicos, los cuales, un haz de electrones reemplaza al haz de luz. Hay dos tipos de microscopios electrónicos: el microscopio de transmisión de electrones (TEM), que se basa en que el haz de electrones atraviesa la muestra a examinar, por lo tanto, necesita muestras muy finas; y el microscopio de barrido (SEM), que se basa en que los electrones rebotan sobre la superficie de la muestra, dando una imagen de la superficie a examinar. MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO: Es la microscopía utilizada normalmente en Biología. Un esquema de este tipo de microscopio puede verse en la figura adjunta y es el que describimos a continuación. El estativo es una pieza fuerte y pesada de acero que soporta todos los demás elementos y da apoyo y seguridad a todo el aparato. La fuente de iluminación es una lámpara que se enciende al conectar a la red y mover el interruptor, al que está incorporado un reóstato (1-10) que gradúa la intensidad lumínica de la lámpara. La luz es recogida y dirigida por una serie de lentes colectoras a las que pueden acoplarse filtros que seleccionan la longitud de onda necesaria. Así la luz llega a un orificio, el diafragma, regulable, que permite el paso de mayor o menor cantidad de luz. Una vez atravesado el diafragma llega a una lente, el condensador, que reúne los rayos lumínicos para evitar pérdidas. La condensación ideal del haz de rayos se consigue moviendo esta lente con el tornillo de enfoque del condensador. Encima del condensador se encuentra la platina en la que se coloca el portaobjetos con la muestra a examinar. El portaobjetos se fija con las pinzas existentes al efecto y se mueve con los tornillos correspondientes, una hacia delante y hacia atrás y el otro de izquierda a derecha. La luz atraviesa el objeto produciendo una absorción de la misma de diferente intensidad, según los puntos, lo que constituirá la imagen que se va a ver ampliada por los sistemas de lentes del tubo. La lente objetivo amplía la imagen del objeto produciendo una imagen real dentro del tubo, esta imagen es amplificada nuevamente por las lentes oculares que producen una imagen virtual e invertida, imagen que es captada por el ojo.

2 Nuestro microscopio posee cuatro objetivos situados en un soporte circular, el revólver; tres de ellos (4x, 10x y 40x) son objetivos secos y el cuarto (100x oil) el de inmersión. El cambio de objetivo se realiza por un giro del revólver hasta oír un golpe seco. El aumento total es el resultado de multiplicar el aumento del objetivo por el del ocular (10x). Concretamente con nuestro microscopio se pueden conseguir aumentos de 40, 100 y 400 diámetros con objetivos secos y 1000 con objetivo de inmersión. Normas de utilización: 1.- Con la muestra en la parte de arriba coloque un portaobjetos en la platina u fíjela con las pinzas. Con el tornillo control sitúe la muestra en el agujero central de la platina. 2.- Conecte la lámpara con el interruptor y ajuste el reóstato. Mirando lateralmente aproxime el tubo del microscopio a la muestra sin tocarla, con el tornillo macrométrico. El tubo debe tener seleccionado el objetivo de menor aumento (4x). 3.- Observe por el ocular y levante lentamente el objetivo con el tornillo macrométrico hasta que vea una imagen difusa. NO INTENTE NUNCA ENFORCAR BAJANDO EL OBJETIVO MIENTRA ESTA MIRANDO POR EL OCULAR. Utilice ahora el tornillo micrométrico hasta que vea una imagen nítida. Ajuste ahora el diafragma y el condensador hasta que la intensidad de la luz sea mejor, ni demasiado brillante ni demasiado apagada. 4.- Seleccione la parte de la muestra que desea observar y sitúela en el centro del campo. Coloque ahora el objetivo siguiente (10x), girando el revólver (se oirá un golpe seco).

3 5.- Observando por el ocular enfoque de nuevo con el tornillo micrométrico hasta conseguir una imagen nítida. Ajuste de nuevo el diafragma y el condensador. ADVERTENCIA: NO TOQUE LAS LENTES DE LOS OBJETIVOS. 6.- Repita la operación ahora con el objetivo siguiente (40x). Recuerde que nunca debe bajar el tubo del ocular mirando por el ocular sino observando lateralmente. 7.- Si hay que utilizar el objetivo de inmersión (100x) el enfoque debe ser más cuidadoso que con los otros objetivos. Seleccione con los otros objetivos la parte de la muestra que desea observar y sitúela en el centro del campo. Levante ahora el tubo y coloque, girando el revólver, el objetivo de inmersión. Pongo una gota de aceite de inmersión en la parte de la muestra que está debajo del objetivo. Baje cuidadosamente el objetivo, observando lateralmente, hasta que se sumerja en el aceite, pero EL OBJETIVO NO DEBE TOCAR AL PORTAOBJETOS. Mirando por el ocular levante el tornillo micrométrico hasta que obtenga una imagen nítida. Ajuste la iluminación (condensador y diafragma). Cuando termine la observación limpie el aceite del objetivo y de la muestra con un paño adecuado. Normas de mantenimiento: El microscopio y las lentes deben mantenerse siempre limpias para ello: 1.- NO TOCAR NUNCA LAS LENTES. Si se enuncia límpiese suavemente con el paño. 2.- No deje nunca un portaobjetos puesto cuando no ha de observarse. 3.- Limpie siempre el objetivo de inmersión después de usarlo, aunque vaya a usarse inmediatamente después. Si, involuntariamente, los objetivos secos se manchan de aceite, límpielos inmediatamente. Si el aceite se ha secado o endurecido en las lentes límpielo con un paño humedecido en xilol, pero teniendo en cuenta que un exceso de xilol puede disolver el cemento que une las lentes. 4.- Mantener siempre limpia y seca la platina. Si se derrama sobre ella algún líquido séquela con un paño. Si se marcha con aceite límpiela con un paño humedeciendo en xilol. 5.- No incline nunca el microscopio cuando esté trabajando con objetivo de inmersión; el aceite puede caer en el sistema mecánico en donde es difícil limpiarlo, o en el condensador y allí solidificarse y estropear la lente. 6.- Cuando no se use el microscopio debe estar cubierto con el plástico. 7.- No forzar nunca ningún mecanismo. Si algo no funciona con suavidad comuníquelo al profesor. 8.- Las lentes objetivo nunca deber tocar el portaobjetos. 9.- No bajar nunca el tubo con el tornillo macrométrico mientras se mira por el objetivo. Siempre debe hacerse mirando lateralmente No intercambie nunca lentes de distintos microscopios y nunca separe las lentes frontales de los objetivos Al terminar el trabajo sitúe el objetivo más pequeño y cubra el microscopio con el plástico.

4 1.2. ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS DE UNA INFUSIÓN: PROTOZOOS Introducción: Los protozoos pertenecen al reino Protista, también llamado Protoctista, es el que contiene a todos aquellos microorganismos eucariontes que no pueden clasificarse dentro de alguno de los otros tres reinos eucarióticos: Fungi (hongos), Animalia (animales) o Plantae (plantas). Los protozoos son seres unicelulares eucarióticos, heterótrofos, fagótrofos, depredadores o detritívoros, a veces parcialmente autótrofos, que viven en ambientes húmedos o directamente en medios acuáticos, ya sean aguas saladas (formando el plancton) o dulces, la reproducción puede ser asexual por bipartición y también sexual por isogametos o por conjugación intercambiando material genético. Cuando las condiciones del medio se vuelven adversas, como es el caso de una desecación, se rodean de una envuelta resistente y reducen al mínimo su actividad vital, se produce un enquistamiento. La clasificación de los protistas ha variado mucho en los últimos veinte años, debido a que este reino constituye un taxón parafilético puesto que se basa en el carácter plesiomórfico de la unicelularidad. Por tanto, en estas prácticas vamos a estudiar a los protozoos según una sencilla clasificación que trata a los protozoos como un sólo filo dividido en cuatro clases basadas sobre todo en el modo de locomoción (Honigberg & col. 1964): Rizópodos o sarcodinos (Rhizopoda). Estos protozoos, como las amebas, se desplazan por medio de pseudópodos, es decir, formando apéndices temporales desde su superficie y como proyección del citoplasma. Los pseudópodos son deformaciones del citoplasma y de la membrana plasmática que se producen en la dirección el desplazamiento y que arrastran tras de sí al resto de la célula. Los pseudópodos también son utilizados para capturar el alimento, que engloban en el interior, en el proceso llamado fagocitosis. Según los pseudópodos sean muy gruesos o muy delgados, son de dos tipos: con lobopodios (gruesos) como Lobosea (Amoebozoa) y con filopodios diversos generalmente acompañados de un exoesqueleto con microtúbulos y son tales como: radiolarios, foraminíferos, nuclearias, heliozoos y otros. Ejemplo: Amoeba proteus Ciliados (Ciliophora). Los ciliados son uno de los grupos más importantes de protistas, comunes en casi todos los lugares donde hay agua: lagos, charcas, océanos y suelos. Pueden ser móviles o sésiles y la mayoría se alimenta de organismos pequeños (bacterias, algas u otros protozoos) o de detritus, mientras que otros muchos son simbiontes, y algunos son parásitos obligados u oportunistas. Los cilios resultan similares a los flagelos, pero difieren de ellos en que son más cortos y numerosos; además están distribuidos alrededor de toda la superficie celular. Una sola célula de una especie del protozoo Paramecium tiene entre y cilios. No actúan todos al unísono, sino que normalmente baten de manera coordinada, con una onda de movimiento que recorre la célula. El paramecio (género Paramecium) es un representante muy popular del grupo. Ejemplos: Stentor, Vorticella y Paramecium. Flagelados o mastigóforos (Mastigophora). Se distinguen por la posesión de uno o más flagelos. Los flagelos son filamentos más largos que los cilios cuyo movimiento impulsa a la célula. Suelen presentarse en un número reducido. Las formas unicelulares desnudas (sin pared celular), dotadas de sólo uno o dos flagelos, representan la forma original de la que derivan todos los eucariontes. Por eso son tantos y tan variados los protistas diferentes que encajan en este concepto. Las plantas por ejemplo derivan ancestralmente de protozoos biflagelados que adquirieron los plastos por endosimbiosis

5 con una Cyanobacteria. Varios protozoos portan plastos y son por lo tanto autótrofos o mixótrofos como los dinoflagelados y euglenas. Los Metamonada tienen dos o múltiples flagelos, son anaerobios y en su mayoría simbiontes o parásitos de animales. Entre los uniflagelados están los coanoflagelados, ancestrales de los animales y los quitridios, ancestrales de los hongos. Ejemplos: Euglena, Volvox. Esporozoos o Apicomplexa. Parásitos con una fase de esporulación (división múltiple) y sin mayor movilidad. Hay varios grupos distintos sin mayor relación y no son todos protistas, sino que también hay animales y hongos. El ejemplo más conocido es el plasmodio (género Plasmodium), causante de la malaria y que pertenece al grupo de los apicomplejos, grupo más conocido que suele reservar para sí el nombre de Sporozoa. Materiales: Microscopios, cubres, portas, pipetas o cuenta gotas, sacarosa concentrada, azul de metileno (1:24.000), rojo neutro (1:10.000). Preparación de la infusión: En un recipiente con agua se depositan hojas y ramas secas y se dejan a temperatura del laboratorio (20ºC) durante una semana aproximadamente. Conviene añadir fango y hojas de un charco para aumentar la cantidad de materia orgánica. Técnicas y observación: 1.- Observación directa: Con un pipeta o un cuentagotas tome agua de diferentes niveles y deposite de cada uno de ellos una gota en sendos portas limpios, coloque con cuidado un cubre y observe al microscopio con objetivos secos. Verá diferentes microorganismos que nadan en el agua. Con ayuda de los esquemas adjuntos intente identificar algunos. 2.- Observación en medio viscoso: De forma semejante, deposite un gota de infusión en un porta. Añada otra gota de disolución de sacarosa concentrada para aumentar la viscosidad del medio y dificultar la movilidad de los microorganismos, pudiendo ahora observarlos más fácilmente. 3.- Coloración vital: Disponga dos nuevos portas limpios, deposite una gota de infusión en cada uno y coloque el cubre con un proceso semejante. Añada al borde del cubre en un porta una solución de rojo neutro (1:10.000) y en el otro una gota de azul de metileno (1:24.000). Observe al microscopio. Si la observación se hace rápidamente verá como se van tiñendo diferentes orgánulos, de rojo o azul, especialmente las vacuolas; si tarda un poco verá esas estructuras celulares ya teñidas. Describa en el cuaderno el mayor número de especies posibles y dibuje un esquema de cada una; fíjese en si tiene o no caparazón, cómo es, estructura general, presencia o ausencia de cilios, tipo de movimiento, vacuolas, cloroplastos (verdes en algas), etc.

6 Introducción: 1.3. ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS PARÁSITOS La mayoría de los protozoos son de vida libre. Otros establecen relaciones simbióticas con los seres vivos, incluido el hombre. Esta adaptación al hospedador tiene como consecuencia la aparición de modificaciones fisiológicas, estructurales y morfológicas en relación a sus homólogos de vida libre. Cuando el ciclo se desarrolla en varios huéspedes se denomina huésped definitivo a aquel en el que tiene lugar la reproducción sexual e intermediario en el que se produce la reproducción asexual. La transmisión desde el reservorio al huésped susceptible puede ser: 1) directa (Ej. Trichomonas vaginalis); 2) indirecta por ingestión (Ej. Entomoeba hystolitica a través del agua o alimentos contaminados), contacto (Ej. Naegleria) o a través de vectores activos (Ej. Plasmodium) o pasivos (Ej. Giardia intestinalis a través de alimentos contaminados por moscas). Para asegurar su supervivencia en condiciones desfavorables muchos protozoos se transforman en un quiste que no es más que una fase de resistencia. Es una estructura rodeada de una pared gruesa que protege al microorganismo del ambiente externo hostil. Materiales: Microscopios Preparaciones

7 ANEXO I: EJEMPLOS DE PROTOZOOS: Algas verdes: Escenedesmus: Las células presentan una asociación lineal en zig-zag. Las del extremo con dos formaciones largas de aspecto espinoso. Forma parte del plancton de las aguas dulces. (Fig. 1: aumentada 600 veces). Volvox: Células unidas en agrupación o cenobio de forma esférica, con flagelos móviles. En el interior se agrupan los individuos hijos en un nuevo cenobio muy grande. Por su tamaño casi llegan a percibirse a simple vista, hasta 0,5 milímetros de tamaño. Forman parte del plancton y deben tratarse con mucho cuidado las muestras de agua que contienen esta alga. (Fig. 1) Gonium: Agrupación de células ciliadas, en una masa de aspecto gelatinoso, en forma de diminutas plaquitas. Forma parte del plancton de agua dulce. (Fig.1: aumentada 400 veces). Eudorina: Colonia de células de forma esférica, gelatinosa, con células flageladas. La colonia suele estar compuesta por 8, 16, 32 y hasta 64 células. Viven en los estanques, desagües de depósitos, lagos,etc. (Fig. 1: aumentada 500 veces). Diatomeas: Figura 1: Algas verdes. Las diatomeas o algas silíceas son algas unicelulares, que viven libres o adheridas a un soporte por un fino pedicelo, también agrupadas por una sustancia gelatinosa. Cubiertas de un caparazón de naturaleza silícea, formada por dos partes y encajadas ambas como lo hacen una caja y su tapa correspondiente. El caparazón o frústulo presenta estrías o grabaciones de extraordinaria figura y perfección. Poseen pigmento vegetal, de tonalidad parda, debido a la feofeína. Melosira: Células en forma de discos de poco grosor. Con puntuaciones muy finas en el caparazón. En filamentos muy largos. Forma parte de plancton. Vive en ríos, lagos, estanques, depósitos de agua. (Fig.2: aumentada 600 veces). Pleurosigna: De forma finamente contorneada. Ambas valvas presentan una estría longitudinal muy acusada, rafe. Estrías transversales muy finas, por lo que se emplean las preparaciones de esta diatomea para comprobación de las lentes de los microscopios. Vive en las aguas dulces y salobres formando parte del plancton. (Fig.2 aumentada 300 veces).

8 Pinnularia: De forma regular ovalada. Se destaca el rafe central por su configuración en el centro y en los extremos. Las estrías laterales muy acentuadas. Forma parte del plancton de las aguas dulces. (Fig.2: aumentada 600 veces). Coconema: Rafe central arqueado por la forma típica de la valvas. Con muchas variedades de formas afines. Forma parte del plancton. Navicula: Uno de los géneros más ricos en variedad de especies. Viven en todos los medios, aguas dulces, salobres y marinas. Rafe muy fino, como asimismo las estrías transversales de las valvas del caparazón. Sarcodinos: Figura 2: Diatomeas Heterofris: Animal envuelto en una cubierta mucilaginosa. En el endoplasma suelen vivir pequeñas algas en simbiosis con el animal. Vive en aguas dulces y salobres. Tamaño: 70 µm. (Fig.5) Actinofris: Cuerpo esférico con el protoplasma de aspecto esponjoso por la gran abundancia de vacuolas. Vive en las charcas y estanques, sobre las plantas acuáticas; es muy abundante. Tamaño: 50 µm. (Fig.5) Actinosferium: Protoplasma muy vacuolado en la zona externa, en la interna lleva varios núcleos. Vive en las plantas acuáticas. Tamaño más frecuente, 200 µm. Algunos ejemplares pueden medir un milímetro de diámetro. (Fig.5) Amoeba proteus: Puede formar numerosos pseudópodos gruesos y lobulados en todas las direcciones. Con una vacuola contráctil, bien visible por lo general. Vive en las aguas claras y limpias, estanques, charcas. Tamaño en extensión normal hasta de 300 µm; es de las mayores especies. (Fig.5) Figura 5: Sarcodinos

9 Algas conjugadas: En los estanques de aguas tranquilas y limpias, como asimismo en las charcas, depósitos del agua de bebida, suelen aparecer flotando mechones o manojos filamentosos, de algas verdes. Al tomar estos manojos de algas se pueden observar que están constituidos por largos filamentos que al tacto dan una sensación gelatinosa. Espirogira: Células unidas en largos filamentos y recubiertas de una capa de mucílago. Cada célula tiene uno o varios cromatóforos acintados y dispuestos helicoidalmente. En la cinta del cromatóforo se destacan gránulos: los pirenoides. Flagelados o mastigóforos: El carácter diferencial es la presencia de uno o más flagelos, o látigos, que le sirven para moverse, para la captura del alimentos, o como órgano sensorial. Euglena: Flagelado provisto de abundantes cromatóforos verdes. La superficie del cuerpo presenta finas estrías en forma de espiral. En la porción anterior tiene un pequeño citostoma con una citofaringe reducida. Por el citostoma sale el flagelo, que en su base de inserción en el animal presenta un estigma, gránulo de color rojo sensible a la luz. Abundan en agua de charcas, en la primavera, a las que impregna de un vivo color verdoso por la gran abundancia de ejemplares, nadando libremente o fijándose a los objetos por un pedículos gelatinoso. Talla variada, de µm, según las especies. (Fig. 6) Pleuromonas: Con dos flagelos que nacen de una escotadura o depresión lateral. Animal con forma de habichuela, muy pequeño. Vive en las infusiones, nadando a tirones o saltos rápidos. Talla reducida, 5-9 µm. (Fig. 6) Clamidomonas: Con el cuerpo de forma elipsoidal o esférico. Los dos flagelos en la porción anterior. En estado de reposo, el contenido celular tiene color rojo. Puede dar pigmentación rojiza a las aguas de las lluvias o a la nieve. Tamaño reducido, 5-10 µm. (Fig. 6) Peridinium: Son unicelulares. La célula contiene cromatóforos, amarillos o pardos. El cuerpo está cubierto de una membrana celulósica formada por varias piezas, que le dan un aspecto reticulado. Por lo general se distinguen en la superficie celular dos surcos, uno longitudinal y otro transversal. Vive en las aguas dulces en general. Talla, de 50 a 70 µm. (Fig. 6) Figura 6: Mastigóforos

10 Trypanosoma cruzi: Parásito que produce la enfermedad de Chagas en América. La diseminación del T. cruzi se da por el contacto con las heces de insectos del tipo hemípteros (chinches) entrando los parásitos por la herida causada por su picadura; llegan al torrente sanguíneo viajando hacia los diferentes órganos y tejidos, replicándose principalmente en tejidos musculares y nervioso. Pueden producir cardiopatia chagasica daños irreparables en los plexos mientéricos del tracto gastrointestinal, haciendo que la persona presente megaesófago, megacolon y que eventualmente muera, además de todo esto la persona puede no presentar síntomas lo que beneficia al parásito ya que a través del tiempo sea más patógeno. Trypanosoma brucei: Parásito que causa la tripanosomiasis africana (o enfermedad del sueño) en humanos y animales en África. La especie parasita dos huéspedes, un vector insecto (la mosca tse-tse) y un huésped mamífero. Leishmania donovani: Parásito que produce la enfermedad de Kala-azar. El principal vector de infección son los mosquitos de los géneros Phlebotomus (en el viejo mundo) y Lutzomyia (en América). Sus víctimas son vertebrados: la leishmaniosis afecta a marsupiales, cánidos, roedores y primates. Se estima que unos 12 millones de personas padecen leishmaniosis hoy en día. Se halla en áreas tropicales y subtropicales en todos los continentes, con la excepción de Australia, especialmente en Bangladesh, Brasil, India, Nepal y Sudán. Esporozoos o apicomplexa: Plasmodium: Se conocen más de 175 especies. El parásito siempre tiene dos huéspedes en su ciclo vital: un mosquito (Anopheles) que actúa como vector y un huésped vertebrado. Al menos diez especies infectan al hombre. Para humanos hay cuatro especies de Plasmodium que provocan la malaria o paludismo: P. falciparum, P. malariae, P. ovale y P. vivax, de las cuales la primera es la más virulenta y la que produce la mayor mortalidad. Otras especies infectan a otros animales, incluyendo aves, reptiles y roedores.