PARTE II CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) LIMA LABORATORIO DE CITOGENÉTICA. (01 de Febrero al 01 de Abril del 2016)

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1 N PARTE II CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) LIMA LABORATORIO DE CITOGENÉTICA (01 de Febrero al 01 de Abril del 2016)

2 ÍNDICE PARTE II Página RESUMEN INTRODUCCIÓN OBJETIVOS VII. REVISIÓN BIBLIOGRÀFICA H. Aspectos generales I. Cultivo de papa J. Manejo de invernadero K. Ciclo de vida en papa L. Polinizacion y fertilizacion de flores M. El grano de polen N. Los cloroplastos Lugar y ubicación geopolítica del lugar de ejecución Descripción de la institución Ubicación política Ubicación geográfica Datos climatológicos Plan y cronograma de actividades VIII. DESCRIPCIOÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS IX. CONCLUSIONES X. RECOMENDACIONES XI. BIBLIOGRAFÍA XII. ANEXOS... 66

3 RESUMEN El presente informe de prácticas Pre-profesionales realizadas en el CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) - LIMA comprende la descripción de todas las actividades efectuadas durante el periodo de prácticas, debido a la gran importancia que tiene para nuestra formación profesional. En la primera parte de la revisión bibliográfica se desarrolla con la descripción de la institución, ubicación política y geográfica, datos climatológicos, plan y cronograma de actividades indicando la fecha de inicio y culminación de las prácticas. En la siguiente etapa se describe las actividades realizadas en el laboratorio de citogenética y en el invernadero como fueron polinización y fertilización de flores para la producción de semilla hibrida botánica de papa, determinación de viabilidad de polen, cultivo de polen in vitro, conteo de cloroplasto en las células guarda de las estomas. En la etapa final, se encuentran las conclusiones y recomendaciones que se debe tener en cuenta referente a las actividades realizadas. Por ultimo están los anexos para corroborar las prácticas realizadas.

4 INTRODUCCIÓN El presente informe describe las prácticas pre profesionales, realizadas en el Centro Internacional de la Papa (CIP-Lima) que es un organismo internacional sin fines de lucro dedicado a la investigación agrícola de la papa, camote, raíces y tubérculos andinos. Se dedica a lograr seguridad alimentaria, mejorar el bienestar y la equidad de género para las personas pobres en los sistemas de raíces y tubérculos y los alimentos agrícolas del mundo en desarrollo. El periodo de realización de esta práctica profesional fue iniciado el 01 de febrero del 2016 y culminando el 01 de abril del Las labores realizadas consistieron en el uso de diferentes técnicas y procedimientos en manejo de equipos en las áreas de citogenética, dando énfasis en la determinación y viabilidad de polen, conteo de cloroplastos en las células guarda de los estomas, manejo de equipos, preparación de soluciones. Siendo de importancia su utilización en los programas de mejoramiento genético del cultivo de papa, la determinación de la viabilidad del polen es un factor esencial para iniciar el plan de cruzamientos, realizar hibridaciones dirigidas exitosas y obtener la semilla híbrida deseada. Siendo indispensable para la formación profesional adquirir estos conocimientos en la utilización de las ciencias agrarias y el uso en la vida profesional, ya que en la actualidad la mayoría de los trabajos de investigación se remonta en la aplicación de conocimientos en las ciencias biológicas como: Citología, Sanidad vegetal, Fitomejoramiento, etc.

5 Objetivo General Conocer y adquirir la máxima experiencia posible en las técnicas y métodos en el área de citogenética. Objetivos Específicos Aprender el protocolo para la determinación de la viabilidad de polen y conteo de cloroplastos. Identificar y determinar polen no reducido 2n, diadas, triadas, etc. Conocer y operar correctamente los materiales, insumos, instrumentos y equipos de laboratorio de Citogenética. Recibir adiestramiento en protocolos, métodos y técnicas para experimentos básicos y complejos. Aprender el manejo de invernadero para la producción de semilla hibrida botánica de papa.

6 VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA A. Aspectos generales En los programas de mejoramiento la citogenética ayuda dilucidar ciertos fenómenos genéticos, como: el apareamiento y entrecruzamiento entre los cromosomas homólogos, la relación entre el polen y pistilo (fertilización-fecundación) e identificación de incompatibilidades, irregularidades meióticas en híbridos, producción de gametos 2n y su relación con la formación de poliploides, etc. La reproducción de las plantas fanerógamas requiere del desarrollo coordinado de las anteras y los pistilos, así como de las sucesivas interacciones que se producen entre ellos. El grano de polen contiene los gametos masculinos o sus células progenitoras y básicamente está formado por una célula vegetativa cuyo citoplasma engloba a las células espermáticas, rodeada por una compleja pared externa. Una vez que el polen ha sido liberado, los granos se pueden activar al absorber agua a través de las aperturas, e inmediatamente las proteínas hidrosolubles salen al exterior del mismo. Esta activación está relacionada con la reacción de reconocimiento polen-estigma, pero puede ser provocada por distintos métodos (atmósfera, mucosas, estigma de otra especie y estigma de la propia especie). Mediante el proceso de la activación, entran en contacto los factores de reconocimiento del polen y del estigma, determinando si un grano de polen germinará o no. Aproximadamente las 2/3 partes de las familias de Angiospermas presentan fenómenos de auto-incompatibilidad. Por ejemplo, un grano de polen puede germinar, pero el crecimiento se puede detener en la superficie estigmática, o a veces, en el interior del estilo, si no se reconoce su compatibilidad (Davis, 1966). B. Cultivo de papa

7 La papa (Solanum tuberosum) se divide en dos subespecies: tuberosum y andígena. La subespecie tuberosum es nativa de la Isla de Chiloé, el archipiélago de Chonos y áreas adyacentes de Chile. La subespecie andígenum es nativa de los andes del Perú y Bolivia. Se conocen alrededor de 3000 variedades de papa. La papa está adaptada a climas fríos y templados, crece en temperaturas de entre 12ºC y 24ºC y es sensible a las heladas, sobre todo en los primeros estadíos. Los suelos ideales son los francos y franco arenosos, fértiles, sueltos, profundos, drenados, ricos en materia orgánica y con un ph de La planta de papa es autógama, con un porcentaje variable de fecundación cruzada, que depende de las variedades. Se sabe que hay variedades que no florecen y otras que son autoestériles, sobre todo si están en ambientes muy distintos a los de origen, pero hay una cantidad importante de variedades que pueden producir semilla fértil (Hidalgo, 1999). El hecho de que una variedad de papa, cultivada en un determinado sitio, pueda florecer y dar frutos, es decir hacer su ciclo completo, nos indica que la planta se adapta bien al lugar. Obtener de esas plantas semillas viables con las cuales se pueda lograr un cultivo productivo es un desafío importante. La papa se propaga tradicionalmente por tubérculo-semilla, aunque desde 1975 en el CIP (Centro Internacional de la Papa en Lima, Perú) se realizan investigaciones y trabajos de campo para la producción a través de semilla sexual (Hidalgo, 1999). Las plantas nacidas de semilla y de tubérculo no son idénticas. De la semilla, nace una plántula con cotiledones y una raíz principal o pivotante. La planta originada de un tubérculo, es un clon, no tiene raíz principal ni cotiledones ya que nace de una yema. Las raíces de un clon, son por tanto, adventicias. El fruto de la planta de papa es una baya, la cual puede presentar una forma redonda, alargada, ovalada o cónica; su diámetro generalmente varía entre 1 y 3 cm, y su color puede ser desde verde a amarillento o de marrón rojizo a violeta. Las bayas, que poseen dos lóculos y pueden contener aproximadamente entre 200 y 400 semillas, se presentan agrupadas en racimos terminales, los cuales se van inclinando a medida que avanza el desarrollo de los frutos. Una planta puede dar en promedio unas 20 bayas. La semilla botánica de papa se denomina en la bibliografía con la sigla SSP (semilla sexual de papa) en castellano o TPS (true potato seed) en inglés. Las semillas son muy pequeñas,

8 aplanadas, de forma arriñonada, y pueden ser de colores claros, amarillentos o con diversos tonos de marrón. En promedio, un gramo puede contener unas 1500 semillas (Hidalgo, 1999). C. Manejo de invernadero Prácticas de asepsia La producción convencional de semilla de papa en invernaderos requiere de estrictas medidas de sanidad para evitar contaminaciones. Asumiendo que todo el invernadero está adecuadamente sellado, ningún tipo de insecto debe ser permitido al interior. La ante cámara debe tener un lavatorio con agua y los siguientes materiales: 2 a 3 mandiles limpios, jabón sólido o líquido, una botella plástica conteniendo hipoclorito de sodio (calcio) al 2 %, papel toalla. Además, a la entrada se debe poner una bandeja con cal viva en polvo o polvo de azufre. Poniendo los zapatos en esta bandeja evita el ingreso de ácaros y esporas de patógenos del suelo al interior del invernadero. Se deben lavar las manos con jabón y agua. Si se van a manipular plantas, además del jabón, el desinfectante también debe ser usado (Centro Internacional de la Papa, 1984). Manejo fitosanitario La colocación de trampas amarillas en 2 o 3 puntos del invernadero no solo ayuda a controlar insectos, sino es útil para detectar su presencia. La malla antiáfida es a prueba de insectos, pero no a prueba de esporas de patógenos. Esporas de Phytophthora, Oidium y otros patógenos pueden atravesar la malla al interior del invernadero y si encuentran condiciones climáticas favorables desarrollarán la enfermedad. En este caso se deben usar fungicidas probados. Se recomienda usar el 50% de dosis recomendada para plantas de papa silvestres. Se recomienda también usar normas de uso seguro de plaguicidas. Cuando se emplea pesticidas, siempre se debe usar equipo de protección (Centro Internacional de la Papa, 1984).

9 Manejo del clima interno Se debe contar con un termómetro de máxima y mínima dentro del invernadero. El operador debe registrar temperaturas diarias: máximas, normales y mínimas. Cuando empieza la tuberización es deseable que las temperaturas máximas nocturnas estén en el rango de 10-15º C y las temperaturas diurnas estén alrededor de 20º C. Las mallas sombreadoras ayudan mucho a reducir las temperaturas diurnas (Centro Internacional de la Papa, 1984). D. El ciclo de vida en papa Hay una generación diploide, que consiste en una serie de divisiones mitóticas, seguido por meiosis. Continúa con una serie de divisiones haploides, seguido de la fusión de dos núcleos haploides (gametos), para dar un diploide. Es convencional llamar a la fase haploide gametofito y el diploide esporofito. Ciclo de vida asexual Reproducción vegetativa de la papa: Asegura la conservación clonal del genotipo, una nueva planta se forma a partir de tubérculos, brotes o yemas dando lugar a clones genéticamente idénticos a la planta original, reproducción que se realiza por mitosis. La propagación asexual ha sido una gran ventaja para los mejoradores de papa puesto que se puede fácilmente obtener un genotipo seleccionado y multiplicarlo. Otro uso práctico de la propagación asexual es el cultivo de tejidos y el cultivo de meristemas para la erradicación de algunos patógenos. Ciclo de vida sexual Reproducción sexual de la papa: Permite que el material genético de dos individuos se combinen y se formen nuevas combinaciones alélicas, requiere de la participación de órganos reproductivos femeninos (pistilos) y masculinos (anteras) y por el proceso de polinización se formen bayas con semillas y cada una de estas constituye un nuevo individuo. El más importante acontecimiento de la reproducción sexual es la creación de variación genética, nuevos genotipos con atributos genéticos de ambos padres pueden estar combinados en las semillas formadas. De dos eventos en la meiosis como es el crossing over en la Profase I y la separación al azar de bivalentes en

10 Metafase I, podemos decir que cada producto es un único genotipo. El uso práctico de la reproducción sexual es lo que constituye una de las formas para la conservación de germoplasma, especialmente silvestre, otro uso es para la producción de semilla verdadera de papa (Furnes & Rudall, 1999). a) Megasporogénesis Este proceso tiene lugar en el tejido del ovario (contiene de 300 a 600 óvulos) y en las células madre de las megásporas, dando lugar a células reproductoras llamadas sacos embrionarios, que contienen al gameto femenino u ovocélula. Una célula materna, megáspora, mediante la I y II división meiótica forma 4 megásporas, los 3 superiores degeneran y la inferior se convierte en megáspora funcional, esta dará origen al saco embrionario, que se agranda por megagametogenesis ocurriendo tres divisiones mitóticas, sin citocinesis que darán origen a 8 núcleos que al orientarse forman el saco embrionario. Uno de los 3 núcleos del extremo micropilar del saco embrionario se trasforma en huevo funcional. Hay varias alternativas en la formación del saco embrionario, la descrita ocurre en la mayoría de las angiospermas (Bhandari, 1984). b) Microsporogénesis Este proceso tiene lugar en el tejido esporágeno de las anteras, los núcleos de células madres del polen son muy largas justo antes de la meiosis y en la formación de las tétradas de las micrósporas la pared de callosa alrededor de cada célula madre del polen puede ser detectada durante la iniciación de la meiosis y en cada nueva micróspora joven de la tétrada, la que es también separada por una capa de callosa después de la II división meiótica, tan pronto como la formación de la pared externa del polen empiece a formarse, la callosa empieza a desaparecer. Las capas meristemáticas que dan origen a las diferentes estructuras u órganos en las plantas, son denominadas L1 que dan lugar a la epidermis (cloroplasto), L2 que forman las hojas, tallos y flor (órganos sexuales) y la L3 que generan los tejidos internos del tallo (Bhandari, 1984).

11 Mitosis Este proceso ocurre en las células conocidas como meristemas (raíces, hojas, flores) y meristemas axilares, estas estructuras tienen la capacidad de dividirse a lo largo de todo el ciclo de vida del organismo. Es un proceso continuo, en el cual se suceden en una secuencia cuidadosamente ordenada los complejos preparativos para la división, por la cual se hace un reparto equitativo del material genético ya duplicado entre las dos células resultantes, manteniendo así la ploidía original de la célula. Implica que cada cromátida pueda migrar a un diferente polo, separación que es posible mediante el huso acromático. El más importante carácter de la mitosis es que el número cromosómico permanece constante a través de sucesivas divisiones celulares, con una exacta distribución de cromosomas en las nuevas células formadas, genéticamente idénticas entre sí, manteniéndose la ploidía original de la célula (Alemany, 1985). Interfase: Es el periodo entre las sucesivas divisiones donde los cromosomas son prácticamente invisibles aún con la ayuda del microscopio, durante esta fase antes que la célula se divida tiene lugar la replicación, que es la síntesis del ADN y formación de las fibras que conforman el uso mitótico o spindle bipolar. Este periodo pertenece a las etapas G1, S, G2. El genoma completo se replica una y solo una vez en cada ciclo (Alemany, 1985). Profase: En esta etapa se aprecia la aparición nítida de los cromosomas en el núcleo, ya están suficientemente condensados y son visibles bajo el microscopio óptico. Se ve, que cada cromosoma consiste en dos copias longitudinales, llamadas las cromátidas hermanas, se observan claramente unidas por los centrómeros, el nucléolo pierde visibilidad, la membrana nuclear desaparece, el huso acromático va tomando cuerpo y muchas fibras cortas lo forman, las fibras polares, que llegan desde cada polo del huso a la región central hasta la mitad y las fibras cinetocóricas que se insertan en los cromosomas duplicados. Como vemos, estos dos grupos de fibras posibilitan la separación de las cromáticas hermanas durante la mitosis, los cromosomas inician

12 un proceso de acortamiento y engrosamiento. Al final de la profase, los cromosomas están completamente condensados y con la desaparición de la envoltura nuclear, quedan en contacto con el citoplasma (Alemany, 1985). Metafase: En esta etapa, los pares de cromáticas, se acortan y se alinean en un solo plano alrededor del centro de la célula, se observan más gruesas (Alemany, 1985). Anafase: En esta etapa se duplican y separan los centrómeros y las cromáticas hermanas se liberan, se repelen y son engarzadas por las fibras del huso que hacen tracción sobre ellas, dirigiéndose a los polos, convirtiéndose cada cromátida en un nuevo cromosoma. A medida que continúa la anafase, los dos conjuntos idénticos de cromosomas se mueven hacia los polos opuestos del huso (Alemany, 1985). Telofase: Al iniciarse esta etapa se nota la futura región nuclear y aparece la membrana nuclear, los cromosomas pierden su estado de condensación y se alargan. Comienza la formación del nucléolo. Se produce simultáneamente la citocinesis, o sea la segmentación y separación del citoplasma, se termina de formar la placa celular, la nueva pared celular entre las células recién formadas (Alemany, 1985). Meiosis Este término se deriva del griego meioum (reducir). Cada organismo tiene un número de cromosomas característico de su especie. Este proceso ocurre antes de la formación de las células reproductivas o esporas, en el cual el número diploide normal se reduce a un juego único o haploide (n) en cada gameto, el número haploide se designa como n y el número diploide como 2n. La

13 meiosis es también precedida por una fase S, durante la cual ocurre la síntesis de ADN (algo de síntesis de ADN ocurre durante la primera profase de la meiosis). Antes de iniciarse la meiosis el material genético en el núcleo diploide ha sido replicado sólo una vez, cada cromosoma consiste de dos cromátidas hermanas idénticas (Alemany, 1985). Consiste en dos divisiones nucleares sucesivas, ellas son distinguidas como meiosis I y meiosis II. La comprensión del proceso de la meiosis es fundamental para interpretar el proceso y función de la recombinación genética en la evolución cromosómica. Todo este proceso es dinámico, abarca atracción, apareamiento, intercambio y ulterior separación de los cromosomas homólogos paternos y maternos. Durante este proceso cada gameto lleva sólo un miembro de cada par de homólogos. En toda célula diploide, cada cromosoma proviene del gameto de uno de los progenitores y su pareja, del gameto del otro progenitor, estos pares de cromosomas se conocen como pares homólogos, los que se asemejan en tamaño, forma y en el tipo de información hereditaria que contienen. Además de mantener un número constante de cromosomas de generación en generación, es una fuente de nuevas combinaciones de material genético dentro de los mismos cromosomas (Alemany, 1985). La división meiótica tiene tres importantes eventos: 1. Transformación de los cromosomas por la ocurrencia del entrecruzamiento (crossing-over) en combinaciones completamente nuevas. 2. Re-arreglo del genoma por una distribución al azar de los cromosomas homólogos. 3. Reducción del número de cromosomas de diploide (2n) a haploide (n). De estos eventos, el más decisivo es la recombinación, siendo probablemente la más importante contribución a la evolución y a la diversidad genética. E. Polinización y fertilización Cuando las anteras se tornan dehiscentes, los granos de polen son transferidos al estigma por los insectos o la mano del hombre. Una vez en contacto con el estigma,

14 los granos de polen germinan formando el tubo polínico. En cada una de las microsporas haploides formadas durante la meiosis, el núcleo se divide por mitosis y desarrolla un grano de polen bicelular (gametofito masculino inmaduro). Una de las células se divide posteriormente otra vez habitualmente después del desarrollo del tubo polínico, dando como resultado tres células haploides por grano de polen: dos gametos masculinos masculinos (núcleo germinativo y núcleo espermático).y la célula generadora del tubo polínico (Carrizo, 1998). El tubo continúa creciendo y entra al óvulo a través del micrópilo. Los dos gametos son entonces liberados dentro de la sinérgida. El saco embrionario contiene 8 núcleos y cada uno con una dotación haploide de cromosomas. Los dos núcleos cerca al centro del saco embrionario son referidos como núcleos polares; la célula huevo u oosfera está situada cerca al micrópilo (Carrizo, 1998). Finalmente un núcleo espermático entra en la célula huevo y el otro se une a los dos núcleos polares, este acontecimiento es llamado doble fertilización, entonces se forma un cigoto diploide, que luego desarrolla en embrión y la unión del otro núcleo espermático con dos núcleos polares, llamado fusión triple resulta en la formación del tejido nutritivo llamado endospermo (3n). Se conoce a este proceso como doble fertilización, este es un proceso complejo, el embrión pasa por sus primeras etapas de desarrollo mientras se encuentra dentro del ovario de la flor, los integumentos se desarrollan en la cubierta de la semilla y el ovario mismo madura y se transforma en fruto (Carrizo, 1998). F. El grano de polen Características del grano de polen El polen maduro presenta una morfología bien definida que por lo general permite la identificación de la planta de la cual procede. Sus caracteres son de gran importancia en cualquiera de las aplicaciones que tiene el estudio del grano de polen, entre ellos, generalmente, se definen los siguientes: pared, aperturas, simetría y polaridad, agregados polínicos, forma y tamaño (Erdmant, 1966). La pared del grano de polen

15 Un grano de polen está constituido por dos partes: la célula viva y la esporodermis o pared externa. Por lo tanto, la función primaria de la pared del polen es la protección del protoplasma celular, mediante la impermeabilización y la resistencia a la degradación físico-química y biológica. La naturaleza de la misma proporciona multitud de caracteres importantes en filogenia y para su estudio hay que tener en cuenta su estratificación y su ornamentación. La esporodermis está formada por varios estratos que difieren por sus caracteres químicos, morfológicos y ontogénicos. Consta fundamentalmente de dos capas muy diferenciadas, una interna que está en contacto con el protoplasma celular denominada intina, y otra externa rodeando a todo el conjunto, llamada exina (Erdmant, 1966). a) Exina La exina es la capa más externa y más resistente de la pared del grano de polen. Su resistencia a la destrucción es una de las mayores del reino vegetal, ya que soporta la acción de los ácidos y bases concentradas, así como el calentamiento hasta 300 ºC, siendo únicamente alterada por algunos oxidantes y por ciertos microorganismos. Su componente químico fundamental es la esporopolenina, que se forma por la polimerización de carotenos y ésteres de carotenos oxidados en proporciones variables. Sin embargo, la exina es una capa que presenta una cierta elasticidad y plasticidad, permitiendo al grano de polen adaptarse a las condiciones ambientales. En la exina hay también un componente polisacárido y otro lipídico, así como proteínas, fundamentalmente glucoproteínas (Erdmant, 1966). b) Intina La intina es la capa más interna de la pared del grano de polen. Sus componentes principales son celulosa, pectinas y glucoproteínas. No es resistente a los ácidos y se destruye fácilmente con la acetólisis. Puede considerarse equivalente a la pared de celulosa típica del resto de células vegetales. Forma una capa continua, no interrumpida alrededor de todo el grano de polen. Generalmente la exina está ausente en las aperturas germinativas más complejas, pero la intina es la capa que las recubre exteriormente (Erdmant, 1966). Unidades del polen

16 Las unidades del polen son las agrupaciones, que se producen en muchos granos de polen durante la madurez de los mismos, en el interior de los sacos polínicos. La mayor parte de ellos, en su madurez, forman granos solitarios o mónadas, pero en muchos casos los granos de polen maduros permanecen unidos en: díadas, tétradas, pseudomónadas o criptotétradas, poliadas, masulas y polinias (Camadro, 1986). Díadas: La producción de diadas es bastante infrecuente. Tétradas: Es el tipo más común de agregados polínicos, después de las mónadas, y representan la retención de los cuatro productos resultantes de la meiosis de la célula madre del grano de polen. Poliadas: Las unidades de polen se presentan en un número mayor de cuatro, normalmente 8 ó 16. Consisten en la unión visible o no de tétradas. Masulas: Las unidades de polen son numerosas y normalmente no se pueden contar. Polinias: Consisten en la fusión completa en una unidad de uno o más lóculos de la antera. Determinación de viabilidad de polen En los programas de mejoramiento genético del cultivo de papa, la determinación de la viabilidad del polen es un factor esencial para iniciar el plan de cruzamientos, realizar hibridaciones dirigidas exitosas y obtener la semilla híbrida deseada. Existen distintos métodos para evaluar la viabilidad del polen. Entre los más rápidos y precisos destacan la tinción con colorantes vitales y la germinación en medios artificiales. Las pruebas de tinción tienen ventajas como indicadores de la viabilidad del polen, ya que son más rápidas y fáciles que la germinación del polen; sin embargo, tienden a sobreestimar la viabilidad y el poder germinativo real de los granos de polen (Rodriguez y Dafni, 2000). Si se observan anormalidades, como tétradas o granos de polen con 4 núcleos, significa que la muestra de polen es infértil.

17 En muestras de polen de papas diploides, también podrán observarse granos de polen de un tamaño mayor al de un grano normal, que corresponden a polen con carga genética no reducida (polen 2n). Los conteos se realizan en 250 granos de polen en toda la lámina, y los resultados se expresan como el porcentaje respecto al número total de granos de polen. Además, se propone una escala basada en los rangos de la viabilidad de polen de genotipos promisorios a fin de determinar si pueden ser utilizados como parentales masculinos en los programas de mejoramiento (Tabla 1). Escala Rangos Descripción de la viabilidad 1 0 Estéril 3 <50 Bajo 5 >50-80 Moderado 7 > Alto Tabla 1. Escala para determinar el grado de viabilidad de una muestra de polen de papa (Rodriguez y Dafni, 2000). Germinación in vitro La germinación del polen in vitro permite hacer estimaciones confiables de la fertilidad. Esta técnica simula el desarrollo del tubo polínico en los tejidos estilares, ya que el medio de cultivo utilizado semeja en su composición al mucílago del estigma. Por otro lado, la germinación in vitro depende del genotipo; las condiciones ambientales; la madurez del polen; la composición y el ph del medio, por lo que es necesario determinar las condiciones óptimas para la germinación del polen. El medio de cultivo utilizado para la germinación y crecimiento del tubo polínico de genotipos de papa contiene sucrosa (sacarosa), ácido bórico y polisorbato 20. (Rodriguez y Dafni, 2000). G. Los cloroplastos

18 Los cloroplastos son los plastos de mayor importancia biológica; ya que por medio de la fotosíntesis, en ellos se transforma la energía lumínica en energía química, que puede ser aprovechada por los vegetales. Los cloroplastos como importantes fabricas metabólicas Un aspecto que frecuentemente es olvidado sobre la importancia de los plástidos es que además las funciones particulares de cada tipo, estos organelos llevan a cabo una variedad de procesos metabólicos fundamentales para la estructura y función celular. Algunos de estos procesos parecen provenir del simbionte original, pero otros parecen haber evolucionado de novo como resultado de una coevolución del endosimbionte y la célula vegetal que lo albergó. Entre dichos procesos destacan por su importancia: La síntesis de diferentes ácidos grasos constituyentes de membranas celulares. Biosíntesis de varios aminoácidos requeridos en la síntesis de proteínas citoplásmicas, como glutamato y glutamina. Foto-reducción de nitrógeno. De hecho, los cloroplastos son el sitio inicial de asimilación del nitrógeno para su integración posterior a diferentes rutas metabólicas. Síntesis de las bases púricas y pirimídicas que constituyen a los ácidos nucleicos. Asimilación de azufre. Este elemento mineral que es un macronutriente esencial para las plantas, se requiere predominantemente para la síntesis de amino ácidos azufrados, como metionina y cisteína, y de otros metabolitos secundarios como fitoalexinas, y vitaminas como la biotina. Síntesis de vitaminas. Varias vitaminas que actúan como cofactores de diferentes enzimas son sintetizadas exclusivamente en los plástidos. Además, estos compuestos son suplementos indispensables en la dieta de los animales, incluyendo al hombre. Biosíntesis de hormonas vegetales, como las giberelinas y el ácido abscísico, que regulan el crecimiento y muchas de las respuestas de estrés a cambios ambientales.

19 Biosíntesis de tetrapirroles. Moléculas esenciales como cofactores de diversas proteínas entre las que se incluyen los grupos hemo (acarreadores de oxígeno), las fitocromobilinas (cromóforos) y la clorofila. Actualmente se han identificado algunos tetrapirroles que actúan como moléculas señalizadoras que regulan la expresión genética de algunos genes nucleares. Biosíntesis de metabolitos secundarios.entre otros destaca la síntesis de compuestos pertenecientes a la familia de los isoprenoides (o terpenos). Aunque no todos los isoprenoides se sintetizan en plástidos, el número aquí es muy alto (del orden de miles); pero sobre todo destaca la importancia de sus funciones para diversos procesos vegetales. Conteo de cloroplastos en la células guarda de los estomas Aunque no es considerada una técnica exacta para la determinación de la ploidía de un genotipo de papa, el conteo de cloroplastos en las células guarda de los estomas permite distinguir el grupo diploide de los otros grupos (Huamán, 1995). Para realizar las evaluaciones se requiere colectar de 3 a 5 foliolos jóvenes del tercio superior de cada genotipo que se desea evaluar. Los foliolos se colocan en una placa de Petri que contenga papel toalla o papel filtro humedecido con agua destilada. Promedio del Nº de cloroplastos por célula guarda Posible ploidía 7-8 2x x x x

20 Tabla 2. Promedio de numero de cloroplastos para determinar posible ploidía en el cultivo de papa (Huamán, 1995). 7.1 Lugar y ubicación geopolítica Las prácticas se realizaron en el Centro Internacional De La Papa (CIP), ubicado en Av. La Molina 1895, distrito de la Molina, provincia de Lima, departamento Lima. 7.2 Descripción de la institución El Centro Internacional de la Papa es un organismo internacional sin fines de lucro dedicado a la investigación agrícola de la papa, camote, raíces y tubérculos andinos. Su visión es la de mejorar la vida de los pobres a través de las raíces y tubérculos. El Centro Internacional de la Papa se dedica a lograr seguridad alimentaria, mejorar el bienestar y la equidad de género para las personas pobres en los sistemas de raíces y tubérculos y los alimentos agrícolas del mundo en desarrollo. El Centro Internacional de la Papa busca reducir la pobreza y alcanzar seguridad alimentaria sobre bases sostenibles en los países en desarrollo, mediante la investigación científica y actividades relacionadas con la papa, el camote y otras raíces y tubérculos, y el manejo de los recursos naturales en los andes y otras áreas de montaña. 7.3 Ubicación política Institución: Centro Internacional de la Papa-Lima Distrito : La Molina Provincia : Lima Departamento : Lima 7.4 Ubicación geográfica Latitud del Sur: 12º04'36 del Ecuador. Longitud de Oeste: 76º56'43 de Greenwich. Altitud: 241 msnm. 7.5 Datos climatológicos: Temperatura media anual: C. Humedad relativa : % 7.6 Plan y cronograma de actividades

21 Fecha de inicio: 01 de febrero del Fecha de culminación: 01 de abril del FECHA ACTIVIDADES ENERO FEBRERO MARZO SEMANAS Adiestramiento en Manejo de técnicas y Equipos de Laboratorio Lavado de materiales de vidrio y plástico del laboratorio. 3 Limpieza del laboratorio 4 Esterilización de Placas y envases 5 Manejo de invernadero Preparación del colorante 6 Gelatina de Acetocarmín Glicerol. Preparación de las muestras a 7 evaluar(tinción simple) Conteo del número de 8 cloroplastos en las células guarda Determinación de la viabilidad 9 de polen de papa CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Cuadro N 2: CRONOGRAMAS DE ACTIVIDADES REALIZADAS EN EL LABORATORIO DE CITOGENETICA E INVERNADEROS Fuente: Elaboración propia 2016

22 VIII. DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS MANEJO DE TÉCNICAS Y EQUIPOS DE LABORATORIO Microscopia: Uso del Microscopio Se obtuvo los conocimientos necesarios en el manejo eficiente del microscopio para un mayor análisis y observaciones de muestras en menor tiempo. Primero se observó las características y principios básicos de las características del microscopio. Luego las partes, los diferentes aumentos, resoluciones y técnicas de calibración. Preparación de muestras para observaciones al microscopio. Para una buena observación de las estructuras microscópicas de los elementos anatómicos, histológicos y citológicos de los seres vivos, es necesario emplear una serie de recursos prácticos para inmovilizarlas, endurecerlas, incrementar su índice de refracción, deshidratarlas y segmentarlas para finalmente colorearlas. Se prepararon diferentes muestras simples, en porta y cubre objetos, de diferentes muestras como agua estancada, sobrenadante de suelo, cortes de tejidos vegetales, etc. también se hizo la tinción simple. LAVADO DE MATERIALES DE VIDRIO Y PLÁSTICO DEL LABORATORIO. Para realizar el lavado de los materiales de vidrio en el laboratorio debemos usar guantes para la debida protección, detergente, jabón, rascabuches o cepillo de tubos de ensayo, agua, etc. Todo ello para la adecuada limpieza de estos materiales. Procedimiento:

23 El lavado de los materiales es muy importante para prevenir riesgos de contaminación y precisión de los experimentos. Se procedió a realizar el lavado de estos materiales y fue necesaria la utilización de una corriente de agua y un balde para el enjuague, se lavaron los materiales de vidrio como tubos de ensayo, placas pétri, pipetas, matraces, probetas, frascos etc. Asepsia del laboratorio En el laboratorio de citogenética, la asepsia es lo más importante antes y después de hacer cualquier experimento o prueba. Procedimiento: Se procedió a realizar la desinfección y limpieza de las mesas, repisas, pisos, ventanas, estantes, etc. Antes y después de cada prueba. Lo más importante de la limpieza fue dar una limpieza y esterilización de la mesa de trabajo pues debe estar libre de cualquier microorganismo contaminante, para la cual se usó el detergente y lejía (hipoclorito de sodio) diluida en agua, jabón en agua, y finalmente alcohol de 70 grados. Esterilización de Placas y Envases Después del lavado de materiales de vidrio como placas petri, envases de vidrio, tubos de ensayo y otros, se llevan a la autoclave y se procede a esterilizar a una temperatura de 120 grados Celsius, por 20 minutos. CONTEO DE CLOROPLASTOS EN LAS CÉLULAS GUARDA DE LOS ESTOMAS Aunque no es una técnica para determinar la exacta ploidía de un genotipo, cuando manejamos una gran cantidad de material nos permite discriminar el grupo diploide de los otros grupos. Toma de la muestra

24 Se procedió a colectar hojas o los folíolos terminales de una misma planta y se colocó en una placa Petri con papel toalla o filtro humedecido con agua destilada. Procedimiento Se obtuvo con la ayuda de una pinza fina el tejido epidérmico del envés de la hoja, de la zona próxima a las nervaduras. Inmediatamente se colocó sobre un portaobjetos donde previamente se ha colocado una a dos gotas de solución de KI - I y luego volver a colocar muy suavemente encima de la muestra otras dos gotas de KI - I y cubrir suavemente con un cubre-objeto. Observación: Examinar la preparación bajo el microscopio óptico, a un aumento de 10 X, 20 X ó 40 X. El contaje de cloroplastos se realiza solo en una de las células guarda de las estomas. El número promedio de cloroplastos nos dará una indicación de nivel de ploidía, así para una ploidía 2x en papa, el promedio es de 5-8 cloroplastos por célula guarda, contajes mayores a 9 nos indica un nivel más alto de ploidía. Se recomienda por lo menos obtener el promedio en 10 células guarda. CULTIVO INVITRO DE POLEN Procedimiento: Colocar 4 gotas del medio de cultivo sobre el interior de la tapa de una placa de petri de 5.5 cm de diámetro, distribuyéndolas en los vértices de un cuadrado imaginario. Con la punta de un palillo mondadientes adicionar pequeñísimas cantidades de polen de una misma muestra sobre cada gota, esparciendo el polen con ligeros movimientos circulares Preparar una cámara húmeda destilada cubriendo el fondo de la placa de petri. Cubrir la placa de petri con la contratapa y dejar a una temperatura de 20 a 24 ºC hasta el día siguiente.

25 Colocar una gota de solución de yodo-yoduro de potasio (I-KI) en la tapa de la placa de petri donde se colocó la muestra de polen. Cubrir con una lámina cubreobjeto de mm, y proceder a la observación bajo un microscopio óptico a un aumento de 100 X. Se consideran granos de polen germinados solo aquellos que emitan un tubo con una longitud mayor o igual al diámetro del polen. El conteo de granos de polen germinados y no germinados debe realizarse en un mínimo de 10 campos, y los resultados se expresan como el porcentaje respecto al número total de granos de polen por campo. Un porcentaje promedio del 80% indicará un polen fértil. En la misma figura se puede observar granos de polen que no han germinado. EVALUACIÓN DE VIABILIDAD DE POLEN EN ESPECIES SILVESTRES DE PAPA (Solanum spp) Procedimiento: Se procedió a colectar las flores próximas a la dehiscencia. Luego se colocó una o dos gotas de colorante gelatina aceto-carmín glicerol, en el centro de un porta-objeto. Se colocó el polen una cantidad suficiente con un mondadiente en el centro de la gota del colorante. Luego se procedió a mover ligeramente con el mismo mondadientes para asegurar una distribución uniforme y luego cubrir con un cubre-objeto, dejar por lo menos 24 horas para que los granos de polen se tiñan. Se colocaron las muestran en una mesa o tablero, evitando colocarlas verticalmente hasta después de unos días en que hayan sellado y luego colocar en cajas porta-objetos para guardarlas en refrigeración a 4 C. CRUZAMIENTOS CONTROLADOS Y PRODUCCIÓN DE SEMILLA HÍBRIDA Preparación del sustrato: Se empezó con el lavado de macetas, luego se esterilizo la tierra negra y se mezcló con bromix en una porción 2:1 respectivamente, y se procedió a llenar

26 las macetas. Se procedió a fertilizar con la siguiente formula de N-P-K respectivamente. Se inició con la siembra de los progenitores masculinos días antes de la instalación de los parentales femeninos. Se colocó 1 tubérculo con brotes de 1-2 cm en macetas de 10. Riego: Se monitoreo la humedad del sustrato a nivel de la zona radicular, se ejecutó el riego a capacidad de campo, se recomienda tomar en cuenta los siguientes indicadores, estado fisiológico de la planta y condiciones climáticas. Prueba de virus: Después de días de la instalación se procedió a la recolección de foliolos en bolsas de polietileno aproximadamente un gramo por cada muestra, para la prueba de virus de los tubérculos ahusado y virus t, los cuales se transmiten por semilla. Se recomienda que en el caso de encontrar una planta infectada se descarta inmediatamente con las plantas que encuentran alrededor de la misma. Tutoreo y limpieza: Al desarrollo de las plantas, para favorecer el crecimiento erecto y evitar la caída de la planta por el peso de las bayas considerar un adecuado tutoreo. Se colocó el tutor de bambú en cada maceta paralelo al tallo principal a una distancia adecua para no dañar las raíces. Sujetar el tutor con el twist sin estrangular o quebrar el tallo en 2 a 3 puntos de acuerdo a la necesidad. Se realizó poda de hojas: basales, maduras con bisturí desinfectar con alcohol o agua jabonosa para cada manipulación. Recolección de polen: Se procedió a recolección de las anteras en sobres de papel mantequilla de las flores abiertas y dehiscentes que se las puede identificar

27 observando el poro apical de color marrón de las flores que actuaran como parentales masculinos. Se colocó los sobres con anteras en una mesa desinfectada con focos de 200 watts a una temperatura de C para el secado de anteras Al día siguiente de la recolección de las anteras se procede a la recolección de polen con un pequeño vibrador alrededor del sobre, previa desinfección de las manos y el vibrador con algodón húmedo de alcohol para cada sobre, luego se procedió a retirar las anteras y llenar el polen en capsulas de gelatina con su código respectivo. Las capsulas codificadas con el polen se proceden a guardan en un taper con silica de gel y guardadas en el refrigerador para su conservación. Emasculación: Cuando las plantas de papa empiezan a formar botones florales se procede a la emasculación (que es un procedimiento que consiste en el retiro de las anteras sin dañar el pistilo de los botones florales con una pinza punta fina) para las plantas que actuaran como los parentales femeninos en el plan de cruzamiento determinado. Polinización controlado y dirigido: Con el pistilo receptivo se procede al cruzamiento controlado y dirigido colocando la capsula de polen codificado en el estigma receptivo de la planta, y luego se coloca la etiqueta de cruce para la identificación de la semilla hibrida producida. Prolongación de la fase vegetativa de floración: Se procedió a cortar los estolones expuestos con un bisturí previa desinfección con agua jabonosa para cada planta de los parentales femeninos, este procedimiento inducirá a la planta en prolongar la etapa vegetativa de la floración y no pasar a la fase de tuberización. Cosecha: Unos cuantos días después de la polinización, las bayas empiezan a desarrollarse. Cerca de días, estas bayas estarán listas para su cosecha.

28 Cuando las bayas están maduras se cosechan y se guardan a temperatura ambiental hasta que estén lo suficientemente blandas para extraer suavemente la semilla. Maceración: Cuando las bayas se encuentran blandas y emiten un aroma característico de que las bayas se encuentran listas para la maceración el cual es procedimiento de la extracción de semilla. El número de semillas por baya puede variar desde 50 hasta 500, aunque un promedio generalmente es de 200. Unas 1500 semillas pesan un gramo. Almacenamiento: La semilla extraída de las bayas es secada a temperatura ambiental con humedad relativa baja. La viabilidad de la semilla depende de la temperatura y el contenido de humedad de la semilla en su periodo de almacenamiento. Luego se procede a guardar a 4 C, la semilla botánica identificada el cual puede ser almacenada varios años sin perder su capacidad de germinación.

29 IX. CONCLUSIONES Se aplicaron los principios básicos de la metodología de la investigación científica para el desarrollo de nuevas tecnologías. Se conoció y manipuló correctamente los materiales del laboratorio (pipetas, vasos de precipitación, fiolas, matraces, mechero bunsen, etc), insumos, instrumentos y los equipos tales como el espectrofotómetro, Termociclador, autoclave, etc. Se aprendió el protocolo para determinar la viabilidad de polen y el conteo de cloroplasto en las células guarda. Se recibió adiestramiento en los protocolos, métodos y técnicas para experimentos básicos y complejos. Se aprendió el manejo de invernadero para la producción de semilla hibrida botánica de papa.

30 X. RECOMENDACIONES Para operar los equipos se tiene que hacer mediante la supervisión de la persona capacitada, al menos en sus principios. Investigar más acerca de los avances y protocolos recientes aplicados a la carrera de la facultad de agronomía. Se recomienda utilizar esta técnica de conteo de cloroplastos en la célula guarda solo como una revisión preliminar para la selección de diploides y no para ploidías más altas. Tener mucho cuidado en la manipulación de insumos y reactivos en el laboratorio. Ante cualquier duda acerca de la operación de los equipos, se tiene que consultar antes de proseguir para prevenir errores o accidentes. Se recomienda brindarle un buen manejo agronómico a las plántulas que se encuentran en los viveros ya que de eso va depender su buen desarrollo en campo definitivo.

31 XI. BIBLIOGRAFÍA ALEMANY, J Flor, esporogénesis y gametogénesis de Nierembergia hippomanica (Solanaceae). Bol. Soc. Arg. Bot. 24: BHANDARI, N The microsporangium. In: JOHRI, B.M. (ed.). Embriology of angiosperms. Springer Verlag, Berlín pp CAMADRO, E Los gametos 2n en el origen y la evolución de las angiospermas poliploides. CARRIZO, C Sobre el androceo y el gineceo en la tribu Datureae (Solanaceae) y su implicancia taxonómica. Kurtziana 26: No. 36, enerodiciembre CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA, 1984.Boletines de Información Técnica. Departamento de Capacitación y comunicaciones del CIP. DAVIS, G Systematic embriology of the angiosperms. John Wiley & Sons Inc., New York. 528 p. ERDMANT, G Pollen morphology and plant taxonomy. An introduction to palinology, I. Angiosperms. Hafner, New York. 261 pp. FURNES, C. Y P. RUDALL, Microsporogenesis in monocotyledons. Ann. Bot. 84: HIDALGO, O Producción de semilla básica por selección positiva, negativa y clonal. Fascículo 5.2 en: Producción de tubérculos-semillas de papa Manual de capacitación CIP Centro Internacional de la Papa. Lima. CIP. 13 p. HUAMÁN, Z Técnicas citológicas para determinar el número cromosómico y la fertilidad de las papas. Guía de Investigación CIP 10. Centro Internacional de la Papa, Lima, Perú.18p. RODRIGUEZ-RIANO Y DAFNI, A new procedure to asses pollen viability. Sex. Plant. Reprod. 12:

32 XII. ANEXOS Foto 24.Recoleccion de flores abiertas, con las anteras próximas a la dehiscencia o completamente dehiscentes. Foto 25.Secado de las anteras recolectadas. Foto 26. Extracción del polen en cápsulas de gelatina con la ayuda de un vibrador eléctrico Foto 27. Eliminando las anteras de papa para la obtención de polen. Foto 28. Recolección del polen en capsulas de gelatina. Foto 29.Se coloca una gota de Gelatina de Acetocarmin Glicerol en el medio del porta objeto.

33 Foto 30. Identificando la capsula de polen para la viavilidad de polen de papa de parientes silvestres. Foto 31. Esparciendo suavemente el polen sobre el colorante con la ayuda de un palillo mondadientes Foto 32. Se procede a cubrir con el cobriobjeto la muesra de polen de papa previamente identifcada. Foto 33.Observando y evaluando de la viabilidad de los granos de polen de papa en el microscopio a 200x. Foto 34.Microscopio un equipo fundamental en el área de citogenética. Foto 35. Observación de granos de polen de papa, con tinción de Gelatina de Acetocarmin Glicerol a 400x.

34 Foto 36. Observación de granos de polen de papa, con tinción de Gelatina de Acetocarmin Glicerol a 200x. Foto 37. Observación de 1 grano de polen no reducido 2n y 1 grano de polen no coloreado a un aumento de 200x. Foto 38. Observación de 2 granos de polen estériles (no coloreado) a un aumento de 200x. Foto 39. Observación de 1 triada coloreada y 1 diada coloreada con tinción de Gelatina de Acetocarmin Glicerol a 200x Foto 40. Observación de anormalidades de polen con tinción de Gelatina de Acetocarmin Glicerol a 200x. Foto 41. Observación de 1 triada coloreada con tinción de Gelatina de Acetocarmin Glicerol a 200x.

35 Foto 42.Observación de gran cantidad de granos de polen no coloreados a un aumento de 400x. Foto 43.Colocando el polen sobre las gotas del medio de cultivo. Foto 44.Observación de polen germinando en el medio de cultivo a 100x. Foto 45. Extracción del tejido epidérmico del envés de la hoja. Foto 46. Observación de cloroplasto de un posible genotipo tetraploide. Foto 47.Observación de cloroplasto de un posible genotipo diploide.

36 Foto 48. Cruzamiento dirigido en el cultivo de papa. Foto 49. Identificación de un cruzamiento controlado y dirigido. Foto 50. Recolección e identificación de bayas. Foto 51. Observación del secado de semilla híbrida. Foto 52. Observación del invernadero de cruzamiento. Foto 53. Riego de plántulas.