PNA ISH Detection Kit N de código K5201

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1 PNA ISH Detection Kit N de código K5201 9a edición Para la hibridación in situ mediante sondas PNA conjugadas con fluoresceína. El kit contiene reactivos para un mínimo de 40 pruebas*. * Número de pruebas basado en el uso de 25 µl de sondas y 150 µl de otros reactivos por portaobjetos. ( ) P04101ES_01_K / p. 1/8

2 Índice Página Uso previsto... 2 Principio del procedimiento... 2 Reactivos A. Material suministrado... 3 B. Materiales necesarios pero que no se suministran... 4 C. Preparación de reactivos... 4 Precauciones... 4 Almacenamiento... 5 Procedimiento de hibridación in situ de un día para la detección de ARN mediante sondas PNA Rehidratación... 7 Pretratamiento... 7 Hibridación... 7 Lavado realizado en condiciones de astringencia... 7 Detección... 7 Contratinción y montaje... 7 Notas referentes al procedimiento... 8 Uso previsto Para uso diagnóstico in vitro. El PNA ISH Detection Kit está pensado para la detección de sondas de ácido nucleico peptídico (PNA, por sus siglas en inglés) conjugadas con fluoresceína hibridadas para su ARN objetivo en preparaciones celulares o tisulares. Principio del procedimiento Este kit ofrece al usuario todos los reactivos necesarios para realizar una hibridación in situ para la detección de ARN celular, excepto en el caso de la sonda PNA específica conjugada con fluoresceína. En un corte de tejido o un frotis de células (suministrados por el usuario) se hibrida una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA) conjugada con fluoresceína para su ARN objetivo según el procedimiento expuesto más abajo. Tras la hibridación, se aplica un baño de posthibridación con una solución de lavado realizado en condiciones de astringencia a 55 C durante 25 mi nutos. Posteriormente, se añade F(ab ) de conejo conjugado con fosfatasa alcalina anti-isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés) y el espécimen se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos, tras lo que se aplica un lavado. El uso del fragmento F(ab ) del anticuerpo garantiza que el ligamiento no específico con el espécimen se mantenga al mínimo. Se añade sustrato (sustrato enzimático, BCIP/NBT) y se incuba el espécimen a temperatura ambiente durante minutos, tras lo que se aplica un lavado. Es opcional realizar una ligera contratinción con hematoxilina. ( ) P04101ES_01_K / p. 2/8

3 Finalmente, se monta el espécimen. La tinción positiva se reconoce al microscopio con un color azul oscuro/negro en el lugar de la hibridación. Reactivos A. Material suministrado Vial 1 (2 ml) Vial 2 (0,5 ml) Vial 3 (0,5 ml) Vial 4 (25 ml) Vial 5 (6 ml) Vial 6 (6 ml) Proteinase K (x 10) 10 x proteinasa K concentrada en Tris/HCI a 50 mmol/l, azida sódica a 15 mmol/l, a ph 7,5. Puesto que la proteinasa K se autodegrada, es muy importante almacenar el vial 1 entre 2 y 8 C. Negative Control PNA Probe/FITC (listo para su uso) Sondas PNA aleatorias conjugadas con fluoresceína en solución de hibridación. Contiene un 30% de formamida. Positive Control PNA Probe/FITC (lista para su uso) Sonda PNA conjugada con fluoresceína dirigida contra gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa en solución de hibridación. Contiene un 30% de formamida. Stringent Wash Solution (x 60) 60 x solución concentrada de lavado astringente. Anti-FITC/AP (listo para su uso) Anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina contra la fluoresceína (F[ab ] de conejo aislado por afinidad). Tampón Tris a 50 mmol/l, MgCl 2 a 5 mmol/l, ZnCl 2 a 0,25 mmol/l, 3% BSA, estabilizador, conservante, a ph 7,5. Substrate (listo para su uso) 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) y nitroazul de tretazolio (NBT). Tampón Tris a 100 mmol/l, NaCl a 100 mmol/l, MgCl 2 a 50 mmol/l, conservante, a ph 9,0. Contiene un 1,7% de N,Ndimetilformamida. TBS (Solución salina con tampón Tris, ph 7,5) 3 envases de papel de aluminio, cada uno para 1 l de tampón, a ph 7,5. Cada envase contiene 1,4 g ± 4% de base de tampón Tris, 6,0 g ± 4% de Tris/HCI. 8,75 g ± 4% de NaCl. Disuelva el contenido de cada envase de papel de aluminio en 1 L de agua pura. ( ) P04101ES_01_K / p. 3/8

4 B Materiales necesarios pero que no se suministran 1. Equipo general de laboratorio para procedimientos histológicos. 2. Equipo y sonda PNA específica conjugada con fluoresceína necesarios para el paso de la hibridación. 3. Baño de agua ajustado a 55 C. Se requiere la c apacidad de agitación para el lavado realizado en condiciones de astringencia. 4. Dako Silanized Slides, número de catálogo S Dako Pen, número de catálogo S2002 (opcional). 6. Agua pura (por ejemplo, agua Milli-Q o agua destilada). 7. Medio de montaje, Dako Faramount, número de catálogo S3025, o Dako Glycergel, número de catálogo C0563. C. Preparación de reactivos Tampón TBS Disuelva el contenido de un envase de papel de aluminio de TBS en 1 l de agua pura. Solución de lavado astringente (solución de trabajo) Diluir el volumen necesario de solución de lavado astringente, vial 4, 60 veces en agua pura y precalentar en un baño de agua a 55 C. Proteinasa K (solución de trabajo) Justo antes de su uso, diluya la cantidad necesaria de proteinasa K, vial 1, 1:10 en TBS. Inmediatamente después de su uso, sitúe el vial 1 entre 2 y 8 C (véanse las Notas referentes al procedimiento, 3). Precauciones 1. Para uso por profesionales. 2. Los viales 2 y 3, las sondas PNA de control negativo y positivo, contienen 25-<50% formamida y 1-<3% Cloruro de sodio. Los viales 2 y 3 están etiquetados: Peligro H319 H360 P201 P202 P281 P280 P264 P308 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P405 P501 Provoca irritación ocular grave. Puede perjudicar la fertilidad o dañar al feto. Procurarse las instrucciones antes del uso. No manipular antes de haber leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. Utilizar el equipo de protección individual obligatorio. Llevar guantes de protección. Llevar gafas o máscara de protección. Llevar prendas de protección. Lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. EN CASO DE exposición manifiesta o presunta: Consultar a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con agua cuidadosamente durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto cuando estén presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado. Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. Guardar bajo llave. Eliminar el contenido y el recipiente de acuerdo con las ( ) P04101ES_01_K / p. 4/8

5 normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. 3. El vial 6, el sustrato, contiene 1-<3% de N,N-dimetilformamida y 1-<3% trometamol. El vial 6 está etiquetado: H360 H373 P201 P202 P280 P260 P314 P308 + P313 P405 P501 Peligro Puede perjudicar la fertilidad o dañar al feto. Puede provocar daños en los órganos tras exposiciones prolongadas o repetidas. Procurarse las instrucciones antes del uso. No manipular antes de haber leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. Llevar guantes de protección. Llevar gafas o máscara de protección. Llevar prendas de protección. No respirar vapores. Consultar a un médico si la persona se encuentra mal. EN CASO DE exposición manifiesta o presunta: Consultar a un médico. Guardar bajo llave. Eliminar el contenido y el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. 4. Los envases de papel de aluminio de TBS (Solución salina con tampón Tris, a ph 7,5) contienen 25-<50% trometamol y 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol clorhidrato. Los envases de papel de aluminio de TBS están etiquetados: H319 H315 H335 P280 P271 P261 P264 Atención P304 + P340 + P312 P302 + P352 + P P363 P337 + P313 P405 P501 Provoca irritación ocular grave. Provoca irritación cutánea. Puede irritar las vías respiratorias. Llevar guantes de protección. Llevar gafas o máscara de protección. Llevar prendas de protección. Utilizar sólo al aire libre o en un lugar bien ventilado. Evitar respirar polvos. Lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. Llamar un CENTRO DE INFORMACIÓN TOXICOLÓGICA o a un médico si la persona se encuentra mal. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. Quitar la ropa contaminada. Lavar la ropa contaminada antes de volverla a usar. Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. Guardar bajo llave. Eliminar el contenido y el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. 5. El vial 4, solución de lavado astringente, contiene un 3,6% de trometamol. En las concentraciones en que se presenta el producto, el trometamol no requiere la etiqueta de peligroso. Hoja de datos sobre seguridad de los materiales disponible por solicitud para usuarios profesionales. 6. Los viales 1 y 5, proteinasa K y anti-fitc/fosfatasa alcalina, contienen azida sódica como conservante. La azida sódica (NaN 3 ) es un compuesto altamente tóxico en su forma pura. ( ) P04101ES_01_K / p. 5/8

6 A las concentraciones en las que está presente en el producto, aunque no se clasifican como peligrosas, la azida sódica puede reaccionar con las cañerías de plomo y cobre, lo que formará acumulaciones de azidas metálicas muy explosivas. Al desechar el producto, aclare con agua abundante para impedir que la azida metálica se acumule en las cañerías. 7. El vial 5, anti-fitc/fosfatasa alcalina, contiene material de origen animal. Como con cualquier producto derivado de fuentes biológicas, deben utilizarse los procedimientos de manipulación apropiados. Almacenamiento Los reactivos del kit deben almacenarse a una temperatura de entre 2 y 8 C. Los viales 2 y 3 deben almacenarse en la oscuridad. No utilice el kit después de la fecha de caducidad impresa en el vial. Si los reactivos se almacenan en condiciones distintas de las especificadas, éstas deben ser verificadas por el usuario. No existen signos evidentes que indiquen que este producto sea inestable. Por lo tanto, deben llevarse a cabo controles positivos y negativos en simultaneidad con el ensayo de los especímenes de los pacientes. En caso de que se observen tinciones imprevistas que no puedan explicarse por variaciones en los procedimientos del laboratorio y se sospeche que existe un problema con el producto, póngase en contacto con nuestros Servicios de asistencia técnica. Puesto que la proteinasa K se autodegrada, es muy importante almacenar el vial 1 a una temperatura de entre 2 y 8 C y minimizar la exposic ión a la temperatura ambiente. Procedimiento de hibridación in situ de un día para la detección de ARN mediante sondas PNA Este procedimiento se ha desarrollado para cortes tisulares incluidos en parafina y fijados con formol. Los reactivos incluidos en este kit, así como las condiciones de hibridación y lavado, se han ajustado para obtener resultados óptimos al utilizar sondas PNA Dako conjugadas con fluoresceína. Debe ejecutarse un control de tejido positivo simultáneamente con los especímenes. NOTA: todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente salvo cuando se establezca lo contrario. ( ) P04101ES_01_K / p. 6/8

7 Rehidratación Pretratamiento Hibridación Lavado realizado en condiciones de astringencia Detección Contratinción y montaje Sumerja en xileno los portaobjetos con los cortes tisulares Sumerja en etanol al 99% Sumerja en etanol al 96% Sumerja en agua pura. El recipiente no debe contener RNasa (véanse las Notas referentes al procedimiento, 1) Rodee el espécimen con el Dako Pen, número de catálogo S2002 Sumerja en agua pura Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda (utilice guantes limpios) Justo antes de su uso, diluya la cantidad necesaria de proteinasa K, vial 1, 1:10 en TBS, por ejemplo utilizando 11 gotas del vial 1 (ó 500 µl) en 4,5 ml de TBS (véanse las Notas referentes al procedimiento, 2) Añada 150 µl de proteinasa K diluida a cada corte (véanse las Notas referentes al procedimiento, 3). Inmediatamente después de su uso, vuelva a situar el vial a una temperatura de entre 2 y 8 C. Incube Sumerja los cortes en agua pura Sumerja los portaobjetos en etanol al 96% Deje secar los portaobjetos al aire Añada al corte tisular 1 ó 2 gotas de sonda PNA conjugada con fluoresceína. En cortes separados, añada las sondas de control, viales 2 y 3 Cubra los cortes con un cubreobjetos Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda (para evitar que se sequen los cortes) Sitúe la cámara húmeda en una incubadora (véanse las Notas referentes al procedimiento, 4) Precaliente la solución de trabajo de lavado en condiciones de astringencia (vial 4 diluido a 1:60) a 55 C en un b año de agua Quite los cubreobjetos Sumerja los portaobjetos en la solución de trabajo precalentada de lavado en condiciones de astringencia Ajuste los cortes a temperatura ambiente mediante una breve inmersión en TBS Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda Añada 2 ó 3 gotas de anti-fitc/fosfatasa alcalina, vial 5, a cada corte Incube Elimine el anticuerpo aplicando golpes suaves Sumerja los portaobjetos en TBS Sumerja los portaobjetos en agua pura Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda Añada entre 2 y 5 gotas de sustrato, vial 6, a cada corte (véanse las Notas referentes al procedimiento, 5) Incube Elimine el sustrato aplicando golpes suaves Sumerja los portaobjetos en agua del grifo Realice la contratinción con hematoxilina si procede Monte en Dako Faramount, número de catálogo S3025, o Dako Glycergel, número de catálogo C x 5 min 3 min min ~ 10 s ~ 5 min 1,5 h. a 55 C 25 min a 55 C con agitación 10 s 30 min 2 x 1 min min 5 min 5-10 s ( ) P04101ES_01_K / p. 7/8

8 Notas referentes al procedimiento 1. A partir de este punto del procedimiento y hasta que se haya realizado la hibridación, es importante evitar la contaminación de los cortes con RNasas, por lo que los portaobjetos deberán tocarse sólo con guantes limpios y desechables. Es posible eliminar los restos de RNasa del material de cristal mediante una incubación a 200 C que dure toda la noche. Otros métodos para inactivar la RNasa en las soluciones se describen en Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (véase también en Precauciones). 2. Disuelva el contenido de un envase de papel de aluminio de TBS en 1 L de agua pura (sin RNasa). 3. Puesto que la proteinasa K se autodegrada, es muy importante almacenar el vial 1 a una temperatura de entre 2 y 8 C y minimizar la exposic ión a la temperatura ambiente. La digestión proteolítica óptima puede variar entre bloques de tejido diferentes. Para los cortes congelados y citocentrifugados, la proteinasa K debe diluirse a más de 1:10, por ejemplo 1:100 1:1000, en función de la fijación. 4. En nuestra opinión, un tiempo de incubación de 1,5 horas ofrece una sensibilidad óptima, aunque pueden obtenerse resultados satisfactorios disminuyendo el tiempo de incubación a minutos, en función de la cantidad de objetivo presente en el espécimen. 5. En nuestra opinión, el sustrato (BCIP/NBT), incluido en el PNA ISH Detection Kit, ofrece la mayor sensibilidad, aunque también Dako New Fuchsin (número de catálogo K0625) ofrece resultados altamente satisfactorios. 6. No agite el vial 6 antes de su uso. El sustrato en ocasiones forma un precipitado que puede afectar a los resultados de la tinción si se agita la solución. Fabricado por: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dinamarca Tel Fax Explicación de los símbolos Número de catálogo Límite de temperatura Código de lote Fabricante Producto sanitario para diagnóstico in vitro Mantener alejado de fuentes de calor (consulte la sección Almacenamiento) Añade agua Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Consulte las instrucciones de uso Contenido suficiente para <n> ensayos Fecha de caducidad Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) ( ) P04101ES_01_K / p. 8/8