DOSIS APLICADA DE FSH PARA EL CRECIMIENTO FOLICULAR Y TASA DE OVULACIÓN CON LH Y GnRH PARA LA RECUPERACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS,

Transcripción

1 EL CEPROSIMAD. 2015; 03(1): Presentado: 15/10/2014. Aceptado: 28/12/2014 DOSIS APLICADA DE FSH PARA EL CRECIMIENTO FOLICULAR Y TASA DE OVULACIÓN CON LH Y GnRH PARA LA RECUPERACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS, CHUQUIBAMBILLA-PUNO APPLIED DOSAGE OF FSH FOR FOLLICULAR GROWTH AND OVULATION RATE WITH LH AND GnRH FOR THE RECOVERY OF BOVINE EMBRYOS, CHUQUIBAMBILLA-PUNO Jesus-Angel Titi-Pacosoncco 1, Luis-Vicente Olivera-Marocho 2 y Eyner-Luis Aguilar-Silva 1 (1) Universidad Nacional Amazónica de Madre de Dios. C.P. Medicina Veterinaria y Zootecnia. Madre de Dios Perú. cloningtiti@hotmail.com (2) Universidad Nacional del Altiplano Puno, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Puno Perú. RESUMEN El objetivo del estudio fue determinar el crecimiento folicular con FSH, la tasa de ovulación utilizando LH y GnRH y la recuperación de embriones en vacas del CIP Chuquibambilla de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional del Altiplano - Se utilizaron 8 vacas de la raza Brown Swiss divididas en 4 grupos de 2 vacas cada uno. Se aplicaron 4 protocolos hormonales de superovulación: 1 FSH 400 mg + LH 25 mg, 2 FSH 400 mg + GnRH 0, , 3 FSH 200 mg + LH 25 mg y 4 FSH 200 mg + GnRH 0, g. Evaluándose los ovarios por ultrasonografía los días 0-9 y 16 en este último día también se colecto y evaluó los embriones según el esquema de la S.I.T.E. Las variables número y tamaño de folículos, cuerpos lúteos fueron analizados mediante la prueba de Kruskall Wallis y la prueba de Mann-Whitney, las variables tasa de ovulación, recuperación de embriones y calidad de embriones, fueron analizados mediante la prueba de chi cuadrada. El número y tamaño de folículos estuvo significativamente afectado por la dosis de FSH y el inductor LH (p 0,05), siendo aparentemente superior para los protocolos 1 y 3, comparado a los protocolos 2 y 4, para los días de evaluación 9 y 16. El número y tamaño de cuerpos lúteos fue afectado significativamente por el inductor utilizado LH (p 0,05), encontrándose solo cuerpos lúteos el día 16 de evaluación en ovarios de vacas tratadas con los protocolos 1 y 3. La tasa de ovulación, recuperación de embriones y calidad de embriones, se evaluó en los protocolos 1 y 3, al no existir ovulación en los protocolos 2 y 4. La tasa de ovulación fue similar (p>0,05) 66,7 y 87,5% protocolos 1 y 3 respectivamente; la tasa de recuperación de embriones fue similar (p>0,05) 62,50 y 82,35% protocolos 1 y 3 respectivamente; la calidad de embriones por cuerno uterino y nivel de FSH fueron similares (p>0,05) para ambos cuernos y niveles de FSH. Los resultados hallados se encuentran en los rangos reportados en la literatura. Concluimos que el nivel de FSH y el inductor LH afecta el número y tamaño de los folículos y cuerpos lúteos, asimismo el nivel de FSH no afecta la tasa de ovulación, recuperación de embriones y calidad de embriones. Recomendándose el uso de los protocoles 36

2 1 y 3 para superovulación en vacunos de la raza Brown Swiss en las condiciones descritas en el presente trabajo. PALABRAS CLAVE: Cuerpo lúteo, Embriones, Folículos, Ovulación, Superovulación. ABSTRACT The objective of the study was to determine the follicular growth with FSH, the ovulation rate using LH and GnRH and the embryo recovery in cows from the CIP Chuquibambilla of the Veterinary Medicine and Zootechny Faculty of the National University of the Altiplano - We used eight Brown Swiss cows divided into 4 groups of 2 cows each. Four hormonal superovulation protocols were applied: 1. FSH 400 mg. + LH 25 mg, 2 FSH 400 mg + GnRH g 3 FSH 200 mg + LH 25 mg and 4 FSH 200 mg + GnRH g. Evaluating the ovaries by ultrasonography, the zero, the 9 and 16 day. On the last day the embryos were also collected and evaluated according to the S.I.T.E. outline. The variables: number and size of follicles, luteal bodies were analyzed using the Kruskall Wallis test and the Mann-Whitney test, the variables ovulation rate, embryo recovery and embryo quality were analyzed using the chi-square test. The number and size of follicles were significantly affected by the FSH doze and the LH inducer (p 0.05), being apparently superior for protocols 1 and 3, compared to protocols 2 and 4, for the 9 and 16 evaluation days. The number and size of luteal bodies was significantly affected by the LH inducer (p 0.05), and only luteal bodies were found on the 16 day of evaluation in ovaries of cows treated with protocols 1 and 3. The ovulation rate, recovery of Embryos and embryo quality, were evaluated in 1 and 3, protocols as there was no ovulation in protocols 2 and 4. The ovulation rate was similar (P>0.05) 66.7 and 87.5% 1 and 3 protocols respectively; the embryo recovery rate was similar (P>0.05) and 82.35% 1 and 3 protocols respectively; the embryos quality by uterine horn and FSH level were similar (P>0.05) for both horns and FSH levels. The found results are in the ranges reported in the literature. We conclude that the level of FSH and the LH inducer affects the number and size of the follicles and corpus luteum, and the FSH level does not affect the ovulation rate, embryo recovery and embryo quality. We recommend the use of 1 and 3 protocols for superovulation in Brown Swiss cattle under the conditions described in the present work KEY WORDS: Corpus luteum, follicles, embryos, ovulation, superovulation. INTRODUCIÓN La obtención de la máxima producción en la crianza de cualquier especie animal requiere fundamentalmente buena eficiencia reproductiva (Vivanco, 2000). La técnica de reproducción asistida es útil para el incremento de la superioridad genética en las hembras y aumentar en gran medida el número de crías de animales superiores. La transferencia de embriones es la técnica más utilizada en todo el mundo para multiplicar animales con características deseables desde el punto de vista productivo (Bo et al., 2002); además como fundamento tiene el progreso genético de 3.5% en el hato por año (Gamarra, 2004). El objetivo del control reproductivo es de maximizar el progreso genético, la producción, y la vida productiva de animales superiores. Estas tecnologías de transferencia de embriones permiten manipular el periodo del ciclo estrual, tiempo de ovulación, o los números de los folículos que potencialmente pueden crecer y ovular; la transferencia de embriones se ha hecho popular para producir muchos embriones de un animal superior y transferirlos en animales receptoras menos valiosas (Baruselli et al., 2005). 37

3 La importancia de la transferencia de embriones permite aumentar la cantidad de descendientes que una hembra puede tener en un año; en los bovinos la producción en promedio unos 5 embriones transferibles (Galli et al., 2003). La variabilidad de la tasa de ovulación de las vacas donadoras al tratamiento superovulatorio con gonadotropinas continúa siendo uno de los mayores problemas en los programas de transferencia de embriones (Mapletof et al., 2002; Barros y Nogueira, 2004). Así mismo, se indica que de acuerdo con los antecedentes y experiencias en la superovulación de vacas donadoras de embriones en el altiplano peruano ocurre la falta de ovulación en vacas donadoras (Macedo, 2010). La presente investigación ha evaluado el número y tamaño de folículos que desarrollaron durante la aplicación de gonadotropinas, la acción de la GnRH y LH como inductores de ovulación para obtener embriones en función al desarrollo del cuerpo lúteo. Los datos fueron tomados al inicio del tratamiento; a los 9 días del tratamiento y finalmente al día 16 de la aplicación de los protocolos para la superovulación mediante ecografía. MATERIAL Y MÉTODOS Ámbito de estudio El presente trabajo de investigación se realizó en el Centro de Investigación y Producción de Chuquibambilla de la Universidad Nacional del Altiplano; el cual se encuentra ubicado en el distrito de Umachiri provincia de Melgar, departamento de Puno, a 3,970 m.s.n.m.; en las coordenadas geográficas cuya latitud sur es 14º, 47, 35, longitud oeste 70, (SENAMHI, 2000). El trabajo de laboratorio se realizó en el Megalaboratorio de Transferencia de Embriones y Banco de Semen de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Cuidado de las vacas Las vacas fueron de la raza Brown Swiss multíparas con un manejo alimenticio en pastoreo en potreros que tienen pastos cultivados como alfalfa, trébol blanco y rye grass y complementadas con ensilado de avena. El proceso de ordeño de las vacas en producción es mecanizado e inicia a las 3:30 a.m. en las mañanas y por las tardes el ordeño se realiza a las 3:30 p.m. finalmente los animales descansaban en los cobertizos. Elección de animales en estudio Se utilizaron 08 vacas multíparas y los criterios que se tomaron para la selección de donadoras fueron: Vaca con un periodo post parto no menor de 60 días y ovarios funcionales. Vacas aparentemente sanas ginecológicamente. Vacas con buen estado corporal de la escala de 3-4 (según Bo G. et al., 2005) La distribución de los animales en estudio fue distribuidos al azar. Tabla 1 Distribución de animales donadoras de embrión. NIVELES DE FSH Dosis de FSH 400mg Dosis de FSH 200mg Inductores de ovulación GnRH LH GnRH LH Número de animales Sub total 4 4 TOTAL 8 38

4 Los animales fueron registrados y pintados con pintura de diferentes colores, indicando a que grupo de trabajo correspondia, para realizar una mejor identificación y seguimiento. Procedimiento para la superovulación Las hormonas para superovulación aplicadas a vacas donadoras de embriones fueron los siguientes: Tabla 2 Concentración de hormonas. DOSIS DE FSH E INDUCTORES DE OVULACIÓN HORMONAS FSH400 + LH FSH400+GnRH FSH200+LH FSH200+GnRH CIDR (Dispositivo Intravaginal 1,9 1,9 1,9 1,9 de Liberacion de Progeterona) (g) Benzoato de Estradiol (mg) FSH p (Hormona Foliculo Estimulante porcina) PGF2α (prostaglandina F2 alfa) (µg) LHp (Hormona Luteinizante porcina) (mg) GnRH (g) - 0, , Protocolos según dosis de FSH e inductor: Figura 1 Dosis de FSH LH. Figura 2 Dosis de FSH GnRH. Figura 3 Dosis de FSH LH. Figura 4 Dosis de FSH GnRH. La inseminación artificial de donadoras de las vacas donadoras se realizó con semen congelado provenientes del Banco Nacional de Semen del Perú el día 9 después del inicio del tratamiento superovulatorio, por la tarde se realizó la primera inseminación y el día 10 por la mañana la segunda inseminación; cumpliendo la técnica de la inseminación artificial. En cada inseminación se utilizó 02 pajillas de 0,5 ml de semen congelado. Evaluación con ultrasonido (ecógrafo). La evaluación del ovario se realizó en vacas donadoras de embriones durante el periodo de la experimentación utilizando el ecógrafo transrectal (ultrasonido) modelo B con un transductor lineal-serie de 7,5 MHz (Sanovet-600). En tres etapas a las vacas donantes de embriones: 39

5 Primer examen de ultrasonido se realizó el día del inicio del tratamiento superovulatorio para obtener la imagen del folículo y del cuerpo lúteo de las vacas destinadas al azar por niveles de concentración de FSH + LH y/o FSH+GnRH. Segundo examen se realizó el día 9 del tratamiento superovulatorio para evaluar el desarrollo y crecimiento folicular. Tercer examen final el día 16 para determinar el número de cuerpos lúteos por vacas superovuladas con diferentes tratamientos. La recolección y evaluación de embriones se realizó de la siguiente manera: El día 7 después de la primera inseminación artificial las vacas fueron examinadas por ecografia, con el fin de determinar el número de cuerpos lúteos y folículos luteinizados en cada ovario. Posteriormente se realizó la recuperación de los embriones por el método transcervical no quirúrgico, para lo cual se colocó 5 ml. de lidocaína al 2% como anestesico epidural. Luego se introdujo a través de la cervix una sonda de foley y se conectó a un sistema de dos vías a través del cual se introdujo un litro de medio de lavado (PBS) con suero de albumina bovina al 10%. Los embriones recuperados fueron evaluados y clasificados subjetivamente de acuerdo con el esquema de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones. Análisis estadístico Los datos fueron expresados mediante medidas de tendencia central y dispersión tales como la mediana y la desviación mediana absoluta. Los datos para las variables número de folículos, número de cuerpos lúteos, tamaño de folículos y tamaño de cuerpos lúteos, fueron analizados mediante la Prueba de Kruskall Wallis, donde se tomó datos de los ovarios de las vacas de los grupos destinados de los protocolos de superovulación: protocolo 1 = FSH 400 mg + LH 25 mg, protocolo 2 = FSH 400 mg + GnRH 0, g, protocolo 3= FSH 200 mg + LH 25 mg y protocolo 4 = FSH 200 mg + GnRH 0, g. El cálculo del estadístico de prueba está dado por la siguiente formula: Dónde: k = número de grupos (tratamientos). nj = número de observaciones del j-ésimo grupo. n = número total de observaciones. Rj = suma de los Cuando existen valores igualados, se ajusta el valor de H para los empates dividiéndolo entre: Dónde: T = t 3 t Para la comparación de las medianas de las variables número de folículos, número de cuerpos lúteos, tamaño de folículos y tamaño de cuerpos lúteos, se utilizó la comparación múltiple de Kruskall Wallis utilizando el método de Bonferroni. Para la variable número y tamaño de cuerpos lúteos para el día 16, se realizó la prueba de comparación para dos muestras independientes de Mann-Whitney, para los tratamientos 1 y 3, por que los otros dos tratamientos no presentaron ningún cuerpo lúteo. Los datos para las variables tasa de ovulación, tasa de recuperación de 40

6 embriones y calidad de embriones, fueron analizados mediante la prueba de chi cuadrada, cuya fórmula es la siguiente: x ( o e = x k k 2 2 i i ) c i= 1 ei 2 ( 1) Donde: o i = Es el número observado de casos en la categoría i-ésima e i = Es el número esperado de casos en la categoría i ésima cuando la hipótesis nula es verdadera. K= Es el número de categorías. Los datos fueron procesados utilizando el programa estadístico SPSS 17 por Ibañez (2016). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Crecimiento y desarrollo folicular: El número de folículos para los cuatro protocolocos de superovulación, según día de evaluación se detalla en la tabla 3, donde se observa el número de datos utilizados (ovario) para cada protocolo, el valor de la mediana, la desviación media absoluta y los valores mínimos y máximos, para el número de folículos por vacas donadoras, para los días de evaluación 0, 9 y 16. Tabla 3 Número de folículos para 4 protocolos de superovulación según día de evaluación. Protocolo Día 0 Día 9 Día 16 N Me DMe Min-Max N Me DMe Min-Max N Me DMe Min-Max FSH LH 4 2,5 b 0, ª a FSH GnRH 4 2,5 b 0, ,5 ab 0, b 0,5 1-3 FSH LH 4 4 a 0, ab c 0 2 FSH GnRH 2 2,5 ab 0, b 0, ab 0, Nota: Para cada protocolo según día de evaluación letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p 0,05). N = número de datos, Me = mediana, DMe = desviación mediana absoluta. El día cero de evaluación (Pre experimental), al realizar la prueba de comparación múltiple de Kruscal Wallis nos indica que las medianas presentan diferencias estadísticas significativas (p 0,05) para el numero de folículos, donde las vacas donadoras del protocolo 3, presentan mayor número de folículos comparado a las vacas donadoras de los protocolos 1 y 2, y número similar de folículos a las vacas donadoras del protocolo 4, así mismo el número de folículos de las vacas donadoras de los protocolos 1, 2 y 4 es similar; lo que nos indica que la asignación aleatoria de las vacas a los grupos experimentales se encuentran en la misma situación para poder realizar el trabajo de investigación el cual se debe a factor fisiológico particular de cada animal; presentan diferente número de folículos; por lo que el patrón de crecimiento folicular durante el ciclo estrual, comienzan con el desarrollo de un grupo de folículos (3 a 6) folículos después uno de estos alcanza al estado de folículo dominante, haciendo que los demás folículos se subordine, sufriendo atresia folicular ( Lopez H. et al., 2005). Por otra parte, en una evaluación ecográfica de los ovarios de vacas encontró de 5 a 20 folículos (Singh J. et al., 2004). El día nueve de evaluación, al realizar la prueba de comparación múltiple de Kruscal Wallis nos indica que las medianas presentan diferencias estadísticas significativas (p 0,05) para el numero de 41

7 folículos, donde las vacas donadoras para el Protocolo 1, presentan mayor número de folículos comparado a las vacas donadoras del Protocolo 4, y número similar de folículos a las vacas donadoras del protocolos 2 y 3, asimismo el número de folículos de las vacas donadoras de los protocolos 2, 3 y 4 es similar. En detalle se observa que existe diferencia entre Protocolo 1 y 4; además que el protocolo 1 es superior y el protocolo 4 es inferior. Es decir que con la administración de FSH en dosis de 400 mg se logra un mayor número de folículos. Con el uso de FSH exógeno es para inducir la superovulación donde los folículos están en diferentes estadios de desarrollo normalmente presentes en los ovarios, donde los folículos pequeños crecen, maduran o se degeneran u ovulan (Benyei y Barros, 2000). Es decir los resultados no son similares a los trabajos realizados por los otros autores puede ser debido a factores diversos como el lugar de realización, además el estado del ovario en el momento del tratamiento parece ser factor determinante en la respuesta superovulatória y, otros componentes de la dinámica folicular, como el tamaño, la distribución y las condiciones de los folículos antrales que pueden afectar la respuesta ovulatória frente al tratamiento hormonal (Visintin et al., 1999). El día dieciséis de evaluación, al realizar la prueba de comparación múltiple de Kruscal Wallis nos indica que las medianas presentan diferencias estadísticas significativas (p 0,05) para el numero de folículos, donde las vacas donadoras del protocolo 3 presentan menor número de folículos comparado a las vacas donadoras de los protocolos 1, 2 y 4; las vacas donadoras para el protocolo 1, presentan mayor número de folículos comparado a las vacas donadoras de los protocolos 2 y 3, y número similar de folículos a las vacas donadoras del protocolos 4, asimismo el número de folículos de las vacas donadoras de los protocolos 2 y 4 es similar. Los problemas de ovulación no ocurren post tratamiento superovulatorio con FSH, el cual se debe por motivos de no poseer cantidad suficiente de receptores de LH para responder al pico de LH (Xu Z. et al., 1995; D Occhio M. et al., 1997). Por lo tanto, indicamos que el mejor inductor de ovulación es la LH, y la GnRH es el peor inductor, el protocolo 1 es igual al `protocolo 4, pero el número de folículos al dia 9 es muy superior ya que FSH LH tiene 24 folículos y FSH GnRH tiene solo 13. Tamaño de folículos: El Tamaño de folículos para los cuatro protocolocos de superovulación, según día de evaluación se detalla en la tabla 4, donde observa el número de folículos medidos para cada protocolo, el valor de la mediana, la desviación media absoluta y los valores mínimos y máximos, para tamaño de folículos por vacas donadoras, para los días de evaluación 0, 9 y 16. Tabla 4 Tamaño de folículos (mm) para 4 protocolos de superovulación según día de evaluación. Protocolo Día 0 Día 9 Día 16 N Me DMe Min-Max N Me DMe Min-Max N Me DMe Min-Max FSH LH 10 5 a 2, ,9ª 1,75 5,7 15,4 8 19,5 a 2, FSH GnRH 10 5 a 1, ,0 b 2, ,0 b 0, FSH LH 15 5 a 2, ,9 a 1, ,0 a FSH GnRH 5 5 a ,5 a 2, , ,0 b 2, Nota: para cada protocolo según día de evaluación letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p 0,05). N = número de datos, Me = mediana, DMe = desviación mediana absoluta. 42

8 El día cero de evaluación, al realizar la prueba de comparación múltiple de Kruscal Wallis nos muestra que no hay diferencias estadísticas significativas (p>0,05) para el tamaño de folículos, de las vacas donadoras para los cuatro protocolos. La falta de diferencia en cuanto al tamaño de folículo para el día cero se debería también a que las vacas donadoras fueron seleccionadas al azar y en la misma fase del ciclo estral. Por otra parte en un trabajo realizado sobre el efecto e intervalo entre reclutamiento folicular en la superovulación de las vacas de la raza holstein en seca fue 3,1±0,22mm. a 4,2±0,8mm; los cuales son similares a nuestros datos obtenidos; además en otro estudio de dinámica folicular la emergencia de una nueva onda de crecimiento folicular en vacas Nelore de 6,42±0,22 mm. (Martins et al., 2005); es decir, mencionamos que las vacas de nuestras unidades experimentales se encontraban en distintos periodos y fases reproductivas; Por lo que nos indican cuando se utilizan progesterona o progestágeno, el programa de super estimulación puede comenzar en forma inmediata. El día nueve de evaluación, al realizar la prueba de comparación múltiple de Kruscal Wallis nos muestra que existe diferencias estadísticas significativas (p 0,05) para tamaño de foliculos, encontrandose un menor tamaño en las vacas donadoras pertenecientes al protocolo 2, frente al tamaño de folículos de las vacas donadoras de los protocolos 1, 3 y 4 donde los tamaños de folículos son estadísticamente superiores y similares entre estos. Esta diferencia se debería a la dosis de FSH del protocolo 2, se debería quizás a la dosis de FSH 200mg y a la respuesta fisiológica propia de las vacas donadoras, ya que aparte de ser más pequeños los folículos también muestra un menor número aparente de folículos estimulados. Al igual que las vacas del protocolo 4 como se muestra en las tablas (1 y 2). De acuerdo con estos resultados, es posible afirmar que el tamaño de folículos desarrollados es muy variable, ya que algunas vacas presentan tamaños grandes y otras relativamente pequeños; por lo que estudios recientes confirman que un incremento de FSH plasmático precede a cada onda de crecimiento folicular en ganado vacuno y puede determinar su inicio, mientras que su descenso es posible que la inhibina y otros factores del líquido folicular actúen directamente sobre el ovario (Adams, 1999). El crecimiento folicular puede ser sincronizado con diferentes drogas tal como progesterona, estradiol, una combinación de progesterona y estradiol, GnRH. El empleo de progesterona o progestágenos en dosis elevadas puede suprimir el soporte de LH para el folículo dominante e induciendo asi la atresia del folículo (Thatcher et al., 2001). El día dieciséis de evaluación, al realizar la prueba de comparación Kruscal Wallis nos muestra que existe diferencias estadísticas significativas (p 0,05) para tamaño de folículos, donde existe un menor tamaño de folículos en vacas donadoras de los protocolos 2 y 4, en comparación de las vacas donadoras de los protocolos 1 y 3. Diferencias atribuidas probablemente, inductor utilizado, ya que los protocolos 1 y 3, exhiben un menor número aparente de folículos (tabla 1) lo cual coincide con el inductor LH frente a los protocolos 1 y 3 con el inductor GnRH. Por otra parte, el mayor tamaño estadísticamente señalado (tabla 2) de los folículos de los protocolos 1 y 3, concordarían también con la dosis de FSH 400 mg. ya que al haber alcanzado mayor número y tamaño en el día 9 su regresión sería más lenta. 43

9 Crecimiento y desarrollo de cuerpos luteos: El número de cuerpos lúteos para los cuatro protocolocos de superovulación, según día de evaluación se detalla en la tabla 5, donde observa el número de datos utilizados (ovario) para cada protocolo, el valor de la mediana, la desviación media absoluta y los valores mínimos y máximos, para el número de cuerpos lúteos por vacas donadoras, para los días de evaluación 0, 9 y 16. Tabla 5 Numero de cuerpos luteos para 4 protocolos de superovulación según día de evaluación. Protocolo Día 0 Día 9 Día 16 N Me DMe Min-Max N Me DMe Min-Max N Me DMe Min-Max FSH LH 2 1 a a FSH GnRH 1 1 a FSH LH 2 1 a a FSH GnRH 1 1 a Nota: Para cada protocolo según día de evaluación letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p 0.05). N = número de datos, Me = mediana, DMe = desviación mediana absoluta. El día cero de evaluación, al realizar la prueba de comparación múltiple de Kruscal Wallis nos muestra que no existe diferencias estadísticas significativas (p>0,05) para el numero de cuerpos lúteos, de las vacas donadoras para los cuatro protocolos. Lo que nos indica que la asignación de las vacas a los grupos experimentales se encuentra en la misma situación para poder realizar el trabajo de investigación. La fase lútea del ciclo estrual de la vaca comprende la formación del cuerpo lúteo y la luteolisis; donde la presencia de cuerpo lúteo nos permite confirmar que los animales en estudio estuvieron en actividad ovárica (Bo, 2004). El día nueve de evaluación (tabla 5), no existe ningún cuerpo lúteo, en los ovarios de las vacas donadoras para los cuatro protocolos. La falta de existencia de cuerpos lúteos le atribuiríamos a la administración de PGF2α el día 8, para los cuatro protocolos (figuras 1, 2, 3 y 4), así como lo asevera (Davidson y Stabenfeldt, 2014), quienes indican que la secreción uterina de PGF2α controla la regresión del cuerpo lúteo en grandes especies no gestantes, incluyendo vacas, yeguas, ovejas, cabras y cerdas; aunque no desempeña un papel natural conocido en perras, gatas y primates. Y en menor cuantia a la administración de FSH (400 y 200 mg), los días 5, 6, 7 y 8 de iniciado el presente estudio, como lo indican los autores mencionados más arriba, quienes indican que especies domesticas grandes presentan un crecimiento folicular significativo hasta que la fase luteica termina, las vacas presentan un folículo antral grande cuando se inicia la fase de luteolisis y en yeguas, el crecimiento folicular puede dar lugar a la ovulación durante la fase luteica. El día dieciséis de evaluación, al realizar prueba de comparación para dos muestras independientes de Mann-Whitney, para los protocolos 1 y 3, por no presentar ningún cuerpo lúteo en las vacas donadoras para los protocolos 2 y 4, nos indica que las medianas no presentan diferencias estadísticas significativas (p>0,05) para el numero de cuerpos lúteos. Esta igualdad le atribuiríamos probablemente, a que en ambos protocolos se usó el inductor de ovulación LH y la falta de cuerpos lúteos 44

10 por falta de ovulación en los protocolos 2 y 4, al uso del inductor de ovulación GnRH. La existencia de cuerpos lúteos para los protocolos 1 y 3, se deberían probablemente, a que la ovulación se produce por un aumento súbito preovulatorio de gonadotropinas inducido por estrógenos, el pico pre ovulatorio de LH (24 horas antes de la ovulación) en la mayoría de especies domésticas, induciría al proceso de luteinización en las células de la granulosa que modificaría la secreción de estrógenos a progesterona, asimismo provocaría la secreción de relaxina, PGF2α y otras sustancias no conocidas que inducirían la ovulación por hidrolisis de la matriz colágena del tejido conjuntivo del folículo pre ovulatorio, (De Rahe; Owens y Fleeger et al, 1980; citado por Klein, 2014). Entonces se concluye que el número de cuerpos lúteos desarrollados fueron similares a los trabajos realizados en otras latitudes. Tamaño de cuerpos lúteos: El tamaño de cuerpos lúteos (tabla 6) para los cuatro protocolocos de superovulación, según día de evaluación se detalla en la tabla 4, donde se observa el número de cuerpos lúteos medidos, para cada protocolo, el valor de la mediana, la desviación media absoluta y los valores mínimos y máximos, para tamaño de folículos por vacas donadoras, para los días de evaluación 0, 9 y 16. Tabla 6 Tamaño de cuerpos luteos (mm) para 4 protocolos de superovulación según día de evaluación. Protocolo Día 0 Día 9 Día 16 N Me DMe Min-Max N Me DMe Min-Max N Me DMe Min-Max FSH LH 2 19,5 a 5, a 2, FSH GnRH 1 23,0 a FSH LH 2 27,5 a 1, a 2, FSH GnRH 1 17,0 a Nota: Para cada protocolo según día de evaluación letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p 0,05). N = número de datos, Me = mediana, DMe = desviación mediana absoluta. El día cero de evaluación, al realizar la prueba de comparación múltiple de Kruscal Wallis (anexos 15) nos muestra que no existe diferencias estadísticas significativas (p>0,05) para el tamaño de cuerpos lúteos, de las vacas donadoras para los cuatro protocolos. La falta de diferencia en cuanto al tamaño de cuerpos lúteos para el día cero se debería también a que las vacas donadoras fueron seleccionadas al azar y probablemente se encuentren en la misma fase del ciclo estrual. El día nueve de evaluación no se observa ningún cuerpo lúteo, en las vacas donadoras para los cuatro protocolos, esto se debería probablemente a las razones señaladas para número de cuerpos lúteos para el día nueve de evaluación (tabla 6). El día dieciséis de evaluación, al realizar prueba de comparación para dos muestras independientes de Mann-Whitney, para los protocolos 1 y 3, por no presentar ningún cuerpo lúteo en las vacas donadoras para los protocolos 2 y 4, nos indica que las medianas no presentan diferencias estadísticas significativas (p>0,05) para el tamaño de cuerpos lúteos. Esta igualdad le atribuiríamos probablemente, a que en ambos protocolos se usó el inductor de ovulación LH y la falta de cuerpos lúteos por falta de ovulación en los protocolos 2 y 4, al uso del inductor de ovulación GnRH, 45

11 esta respuesta también concuerda con el número de cuerpos lúteos para el día de evaluación dieciséis (tabla 3) para los mismos protocolos. Por otra parte, mencionan que se obtienen menor tasa de recolección (ovocitos y embriones en función de los cuerpos lúteos palpados u observados). Se debe a la retención de ovocitos en los folículos luteinizados y en los cuerpos lúteos, retención de ovocitos y/o embriones en los oviductos y niveles muy alto de estrógenos producidos por los grandes folículos no ovulados que bloquearían la capacidad de captación de las fimbrias con la consiguiente caída de ovocitos en la cavidad abdominal (Cabodevila y Torquatri, 2001). Tasa de ovulación según nivel de FSH y tipo de inductor: El resultado de la tasa de ovulación se presenta en la Tabla 7 según nivel de FSH y tipo de inductor de ovulación utilizado en el presente trabajo. La LH desencadena el proceso ovulatorio alrededor de las 24 horas después de alcanzado su pico (Gottfried, 1990). Tabla 7 Tasa de ovulación, según nivel de FSH y tipo de inductor. Protocolo Numero Folículos Numero Cuerpos Lúteos Tasa de Ovulación Día 9 Día 16 Día 16 (%) FSH LH ,7 a FSH LH ,5 a Total Nota: Para cada Nivel FSH e inductor LH para tasa de ovulación letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p 0,05). En la tabla 7, la tasa de ovulación promedio de vacas que fueron superestimuladas con FSH 200mg + LH fue de 87,50 %, en tanto que con FSH 400mg + LH fue 66,70%. Al análisis estadístico no existe diferencia estadística significativa entre ambas concentraciones, siendo mayor para la FSH 200mg (P>0,05). La tasa de ovulación de vacas que recibieron GnRH fue de 0,00%, en tanto que no se observó ovulación en protocolos con diferentes niveles de FSH más inductor de ovulación de GnRH. (Gottfried, 1990). En comparación con nuestro resultados difieren las vacas inducidas la ovulación con GnRH es decir fueron negativos y son similares la respuestas con LH; sin embargo, es importante analizar la presencia de folículos el día 16 del tratamiento superovulatorio; es decir se ha observado folículos lo que indicaría que se ha presentado procesos de luteinizacion en vacas donantes tratadas con inductores de ovulación de GnRH, así mismo que en bovinos, el cortisol endógeno liberado por el stress puede suprimir el pico de LH y la ovulación o disminuir la respuesta superovulatória, que podría confundir la sensibilidad para gonadotropinas exógenas (Costa; Silva y Silva, 2001). Cuando la LH es excesivo durante el tratamiento superovulatorio causa la activación prematura de los ovocitos en vacas superovuladas con FSH y, la alta concentración de LH produce baja fecundación (Benyei B. y Barros C. 2000). Finalmente indica que cerca de 20 a 30% de las donadoras no producen ningún embrión (Baruselli et al., 2005). La evaluación de embriones se realizó según lo indicado por la Sociedad Internacional de Embriones (Robertson y Nelson, 1998). En la figura 5. Se muestra la calidad de 46

12 embriones recuperados de las vacas tratadas con FSH y LH en sus diferentes concentraciones. Donde se lograron obtener embriones de grado 1, 3 y 4 de ambos cuernos uterinos % Figura 5 Calidad de embrión Grado 1 Grado 3 Grado 4 Cuerno uterino derecho Calidad del embrión Cuerno uterino izquierdo Se observa que el número total de embriones obtenidos fue de 24. Donde el 54,17% de los embriones fueron obtenidos del cuerno uterino del lado derecho y el 45,83 % del cuerno uterino izquierdo. El 20,83% de los embriones fueron de grado 1, un 54.17% de grado 3 y el 25% fueron de grado 4. El mayor porcentaje de embriones son del grado 3 ya sea para los que provienen del cuerno uterino derecho (46,15% o del cuerno uterino izquierdo (63,64%). Al análisis estadístico nos indica que la calidad del embrión es independiente del lado de cuerno uterino proveniente, es decir la calidad de los embriones son similares ya sea si provienen del cuerno uterino izquierdo o derecho (P 0,05). La presencia de factores de crecimiento, componentes de la matriz extracelular y del sistema adrenérgico modifica los sistemas de regulación autocrina y paracrina presentes en el oviducto, los cuales actúan para permitir la fertilización y la embriogénesis temprana (Einspainer y Col, 2000). Recientemente se ha encontrado que hay receptores de LH a nivel del oviducto porcino, y durante la fase folicular temprana y el período periovulatorio la estimulación de estos receptores modifica la actividad contráctil a nivel del istmo y del ámpula, disminuyendo la amplitud y frecuencia de las contracciones. Este efecto no fue observado en la fase luteal. Así, la LH puede ser un factor mayor en la sincronización de los eventos previos a la fertilización tales como el transporte de espermatozoides y el transporte del óvulo hasta el ámpula, y posteriormente a través del istmo (Gawroska y Col, 2000). Al modificar la dinámica ovárica, se está modificando indirectamente el complejo entorno oviductal, y estas modificaciones tienen efecto deletéreo sobre la fertilización, el desarrollo embrionario temprano y el momento de llegada del embrión al útero, lo cual también afectará la supervivencia embrionaria. En la figura 6 se muestra la calidad de embriones recuperados de las vacas tratadas con FSH y LH en sus diferentes concentraciones % Grado 1 Grado 3 Grado 4 Calidad del embrión FSH LH FSH LH Figura 6 Calidad de embrión según nivel de FSH. Se observa que el 41,67% de los embriones fueron para el nivel de FSH 400mg + LH y el 58,33% para el nivel de FSH 200mg + LH, se observa que tanto con FSH 400mg+LH y FSH200mg+LH los mayores porcentajes de los embriones son de grado 3 cuyos valores son 50% y 57,14%. Al análisis estadístico no indica que la calidad 47

13 de los embriones no depende o es similar en ambos niveles de FSH (P 0,05). En trabajo realizado en vacas holstein con dosis de 400mg FSHp y dosis de 200mg de FSHp han recuperado el número de embriones transferibles de 2,3±0,5 y 3,3±0,8 y el porcentaje de 38% y 59% respectivamente; el número de embriones degenerados de 1,6±0,4 y 0,7±0,3 y el porcentaje de 37% y 20% respectivamente (Souza et al., 2007). En el ganado superovulado existe una inhibición endógena del pico preovulatorio de LH, el cual puede ser debido al efecto negativo del estradiol, y puede ser tanto en tiempo como en duración de la liberación de LH (Price et al., 1999). No obstante, estos avances, se requieren más estudios para establecer el tiempo preciso para la inseminación, lo cual está determinando por la secreción de LH, el régimen de superovulación y las condiciones medioambientales específicas. En la tabla 8, se muestra el número de embriones recuperados de las vacas tratadas con FSH y LH en sus diferentes concentraciones. Además, cabe indicar que las vacas tratadas con CIDR + BE + FSH y GnRH no se lograron recolectar ningún embrión, y para el grupo de vacas tratadas con CIDR + BE + FSH y LH se lograron colectar 24 embriones y/o ovocitos. Tabla 8 Tasa de recuperación de embriones. Niveles de FSH Número de cuerpos lúteos Número de embriones recuperados Tasa de recuperación de embriones Tasa de recuperación de embriones / vaca FSH LH ,50 5,00 FSH LH ,35 7,00 Total ,73 12,00 Esta tasa de recuperación de embriones en general fue de 72,73%, para el nivel de FSH 400mg + LH fue de 62,50% y para el nivel de FSH 200mg + LH fue de 82,35%. Al análisis estadístico de la prueba de chi cuadrada nos indica que estos porcentajes son similares (P 0,05). El promedio global de embriones obtenidos por vaca fue de 6 embriones, para el nivel de FSH 400mg + LH fue de 5,00 embriones/vaca y para el nivel de FSH 200mg + LH fue de 7,00 embriones/vaca. Por otra parte, en trabajo de efecto de intervalo de reclutamiento folicular de vacas holstein en seca superovuladas el número de embriones recuperados para el G-7 fue de 5,4±0,07 y para el G-14 fue de 5,2±0,08 embriones (Santos y Vasconcelos, 2007). Con el P-36 reportan de 136 colectas realizadas en vacas de la raza nelore un promedio de 13,3±0,75 estructuras y 9,4±0,63 embriones viables (Moraes et al., 2007; Barros y Nogueira, 2005). Con el objetivo de evaluar el efecto de dos métodos de superovulación sobre la producción y calidad de los embriones, se utilizaron 36 vacas Beef Máster de El número de óvulos obtenidos para el Grupo I fue de 6,16 1,35 y de 2,2 0,807 (P<0,05) para el Grupo II. El total de células obtenidas fue de 14,8 1,90 y 9,05 1,25 para el Grupo I y II, respectivamente (P<0,05). (Gallegos et al., 2003) mencionan que la cantidad de embriones producidos por una vaca en particular es muy variable e impredecible, y que el 30% de los tratamientos no producen embriones; en el 30% de las donadoras se obtiene de 1 a 5 embriones y en el 40% de las donadoras se colectan más de 6 48

14 embriones. Sin embargo, en nuestros resultados el número de embriones recuperados son similares a los trabajos reportados por otros autores. CONCLUSIONES Para el crecimiento y desarrollo folicular al día 9 el protocolo 1 con FSH 400 mg + LH 25 mg desarrollo 24 folículos, con diámetro en promedio de 10,9mm. Mientras los protocolos 2,3 y 4 fueron menores. La tasa de ovulación al día 16 post tratamiento, dio mejor respuesta el protocolo 3 = FSH LH 25mg en 87,5% y la formación de cuerpos lúteos fue para el protocolo 1 = FSH 400 mg+ LH 25 mg. Observándose que aplicando GnRH no indujo la formación de cuerpos lúteos. La tasa de recuperación y calidad embrionaria al día 16 post tratamiento, tuvo mejor resultado el protocolo 3 = FSH LH 25 mg con 82,35 % y para la calidad embriones, el protocolo 1 FSH 400 mg + LH 25 mg mostro embriones del grado 1. AGRADECIMIENTO Agradecimiento al Centro de Investigación y Producción de Chuquibambilla de la Universidad Nacional del Altiplano y al Megalaboratorio de Transferencia de Embriones y Banco de Semen de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. BIBLIOGRAFÍA Adams GP, Nasser LF, Bo GA, Garcia A, Del Campo MR, Mapletoft RJ. (1994). Superovulatory response of ovarian follicles of wave 1 versus wave 2 in heifers. Theriogenology 1994; 42: Baruselli PS, de Sa Filho MF, Martins CM, Nasser LF, Nogueira MF, Barros CM, Bo GA. (2006). Superovulation and embryo transfer in Bos indicus cattle. Theriogenology; 65: Colazo MG, Kastelic JP, Davis H, Rutledge MD, Martinez MF, Small JA, Mapletoft RJ. (2007) Effects of plasma progesterone concentrations on LH release and ovulation in beef cattle given GnRH. Domest Anim Endocrinol 2008; 34: Ginther O.J., Knopf Lkastelic J.P. (1989). Temporal Association among ovarian events in cattle during oestrus cycles with two or three follicular waves.j. Reprod.Fertil.1989,87: Gordon, I. (1996). Reproducción Controlada del Ganado Vacuno y Búfalos.Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. Ibañez V. (2007). Estadistica No Parametrica Aplicado a Ganderia. Editorial Universitaria. Segunda edición. Universidad Nacional del Alptiplano. Lucy, M.C. (2007). The bovine dominant ovarian follicle. Journal of Animal Science. 85: E88-E99. Macmillan K. y Thatcher W. (1991). Effects of an agonist of gonadotropin releasing hormone on ovarian follicles in cattle. Journal Biology of reproduction.vol. Nº Martins CM, Castricini ESC, Sa Filho MF, Gimenes LU, Baruselli PS. (2005). Dinamica folicular em novilhas e vacas nelore (Bos indicus) tratadas com dispositivo intravaginal de progesterona novo ou reutilizado associado ou na o a` progesterona injeta vel. Acta Sci Vet 2005;33(Suppl 1):227 (abstract). Park, J.Y., Y.Q. Su, M. Ariga, E. Law, S.L.C. Jin y M. Conti. (2004). EGFlike growth factors as mediators of LH action in the ovulatory follicle. Science. 303: Souza AH, Gumen A, Silva EP, Cunha AP, Guenther JN, Peto CM, Caraviello DZ, Visintin J. Arruda P; Madureira H. Mizuta K. Celeghini C. Asumcao 49

15 E.; Gusmoes P.; Candini H. (1999) Superovulacop de novilhas de raca Nelore com diferentes doses de FSH/LH e Congelacao de embrioes pelo método one step con etilenglicol. Braz. J. Vet Anim. Sci. Vol 39. Vivanco W. (2000). Journal Mejoramiento Genético Bovino a través de Tecnología Reproductiva de Avanzada. 50