UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRONÓMICAS ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN ANIMAL DE CÓRDOBA

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRONÓMICAS ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN ANIMAL DE CÓRDOBA ESPECIALIDAD EN REPRODUCCIÓN BOVINA EFICIENCIA EN LA SINCRONIZACIÓN DE CELOS Y OVULACIÓN DE DOS PROTOCOLOS DE IATF CON UN ANÁLOGO DE LA HORMONA LIBERADORA DE GONADOTROFINAS Y BENZOATO DE ESTRADIOL CON PROGESTERONA EN VAQUILLONAS DE CARNE MV. José Javier de la Mata 2011

2 AGRADECIMIENTOS: Agradecimientos especiales al Ingeniero Agrónomo Bruno Andreotti por su colaboración durante el estudio y a Comercial Calfucurá S.A. por el apoyo y asistencia durante todo el trabajo. 2

3 RESUMEN: En este trabajo se comparó la eficiencia en la sincronización de celos y consecuente ovulación de dos tramientos alternativos. En ellos se indujo un proestro, período comprendido entre la administración de prostaglandina como agente luteolítico y un Análogo de la Hormona Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH) como inductor de la ovulación, de 3 días de duración. Se utilizaron vaquillonas de carne Bos taurus, de entre 16 y 17 meses de edad, que fueron divididas al azar en dos grupos. El grupo 1 (BE 6 d) recibió en el Día cero, 2 mg de Benzoato de Estradiol con la aplicación de un dispositivo intravaginal con 0,6g de progesterona. El grupo 2 (GnRH 5 d) recibió en el Día uno, 10,5 µg de GnRH junto con la aplicación de un dispositivo intravaginal con 0,6g de progesterona. Los dispositivos fueron retirados el Día 6 en ambos grupos, junto con la administración de 150 µg de D-Cloprostenol (PGF). La inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) se realizó a las 72 h desde la PGF (Día 9) y en el mismo momento se aplicó 10,5 µg de GnRH en todos los animales. Durante el transcurso de estos tratamientos, todas las vaquillonas fueron examinadas mediante ultrasonografía transrectal para observar el comportamiento de la dinámica folicular ovárica. El día de inicio de onda de ambos grupos difirió significativamente (P=0,0004), mientras que el tamaño de folículos ovulatorios, el momento de ovulación con diferentes porcentajes, la tasa ovulatoria, las horas medias de ovulación y el porcentaje de concepción (50 % vs 57 %) no difirieron significativamente entre ambos grupos. En conclusión, ambos tratamientos demostraron ser eficientes para la sincronización de celos de vaquillonas de carne en programas de IATF. INTRODUCCIÓN: En los últimos años se ha avanzado en el desarrollo de tratamientos para inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) en rodeos bovinos, basados en la utilización de distintas sales de estradiol y progestágenos (Bó et al., 1995a, Bó et al., 1995b, Caccia y Bó, 1998, Moreno et al., 2001). En la Argentina, estos son los protocolos elegidos por técnicos y médicos veterinarios con los que se alcanzan tasas efectivas de preñez de alrededor del 50 % (Cutaia et al., 2003). 3

4 Hace más de dos décadas que se comenzaron a utilizar agonistas de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), tanto para modificar la dinámica folicular como la función luteal (Thatcher et al., 1989). La introducción de protocolos Ovsynch en programas de IATF (Pursley et al., 1995, Twagiramungu et al., 1995) y sus modificaciones como el CO-synch (Geary et al., 1998), son una alternativa a los estrógenos y progestágenos en sincronizaciones de rodeos de leche y de carne. Una reciente modificación en los tratamientos CO-synch, el CO-synch + CIDR por 5 días con IATF a las 72 h, incrementó las tasas de preñez 10,5 % cuando se los comparó con tratamientos de CO-synch + CIDR por 7días con IATF a las 60 h en vacas de carne (Bridges et al., 2008). Este tratamiento CO-synch + CIDR 5, ha tenido como propósito modificar la duración del proestro que se define como el período comprendido entre la administración de la prostaglandina hasta la aplicación de GnRH como inductor de la ovulación. Este efecto de modificar la duración del proestro en protocolos CO-synch de 5 días con IATF a las 72 h, ha llevado a alcanzar tasas de concepción en vaquillonas de leche de aproximadamente 60 % (Rabaglino et al., 2009) y en otros casos porcentajes superiores (Bridges et al., 2008). Se ha demostrado que la prolongación del proestro, producen mejoramientos en la fertilidad. Los proestros largos (de 2 a 4 días) se relacionan con mejores tasas de concepción a la IATF, con mayores producciones de estradiol, provenientes del folículo dominante, y de progesterona luteal en el ciclo subsiguiente, en comparación con los proestros de corta duración (1 día) (Bridges et al., 2010). El objetivo general de este trabajo es determinar si dos protocolos de IATF, que se fundamentan en el alargamiento del período de proestro, son eficientes para sincronizar los celos e inducir ovulación en vaquillonas de razas para carne. Los objetivos específicos son: -evaluar el día de comienzo de la nueva onda de crecimiento folicular, -la tasa de ovulación a la primera dosis de GnRH, tamaño máximo de folículo ovulatorio, -momento de ovulación y -tasa de ovulación al final de los tratamientos. 4

5 MATERIALES Y MÉTODOS: Este ensayo se llevó a cabo en el establecimiento Santa Elena, localizado en el departamento Conhelo, Winifreda, Provincia de La Pampa. Se utilizaron 28 vaquillonas para carne, Bos taurus cruza, de 16 a 17 meses de edad, con un peso de entre 275 y 335 kg (media 306,42 kg) y con una condición corporal de 5 a 7 (media 6,07) (escala 1 : 9). Estas se encontraban pastoreando en campo natural y en el día de inicio del estudio fueron alimentadas en potreros con alfalfa y otras especies naturales de la zona. Las vaquillonas fueron seleccionadas por peso ( 66 % de peso adulto, es decir 270 kg de peso vivo), ciclicidad (presencia de un cuerpo lúteo o folículo > a 10 mm en sus ovarios por medio de palpación y ultrasonografía) y desarrollo del tracto genital (palpación y ultrasonografía uterina). Las vaquillonas fueron aleatoriamente divididas en dos grupos: Grupo1 (BE 6 d) (n=14) y Grupo 2 (GnRH 5 d) (n=14) (Figura 1). Los animales del grupo BE 6 d recibieron en el Día 0, un dispositivo intravaginal impregnado de progesterona (Emefur 0,6 gr, Merial Argentina SA, Martinez, Pcia Bs As, Argentina) y se les administró 2 mg de benzoato de estradiol ( BE, Syntex SA, Luis Guillon, Pcia. Bs As, Argentina), por vía intramuscular (IM) profunda. En el Día 1, las vaquillonas pertenecientes al grupo GnRH 5 d recibieron un dispositivo (Emefur 0,6 gr, Merial Argentina SA, Martinez, Pcia Bs As, Argentina) junto con la administración de 10,5 µg de GnRH (GnRH, acetato de buserelina, Rosenbusch, Bs As, Argentina) por vía IM. En el Día 6 todas las vaquillonas se inyectaron con 150 µg de D-cloprostenol por vía IM (Emefur Prostaglandina, Merial Argentina SA, Martinez, Pcia Bs As, Argentina), se retiraron los dispositivos y se pintaron las bases de las colas con pintura (PaintStik, LA-CO industries, Inc, EEUU) como método de ayuda para la detección visual de celos. En el Día 9 (72 h posteriores a la PGF) las vaquillonas de ambos grupos recibieron 10,5 µg de GnRH (GnRH, acetato de buserelina, Rosenbusch, Bs As, Argentina), como inductor de ovulación, por vía IM. 5

6 grupo BE 6 d grupo GnRH 5 d 72 hs BE PGF GnRH Disp P4 0,6 gr hs GnRH PGF GnRH Disp P4 0,6 gr Figura 1 Tratamiento utilizados: Las vaquillonas del grupo BE 6 d (n=14) recibieron en el Día 0, 2 mg de benzoato de estradiol (BE Syntex SA.) junto con la aplicación de un dispositivo intravaginal de 0,6 gr de progesterona (Emefur Monouso, Merial Argentina S.A.). En el Día 6 se removieron los dispositivos y se administró 150 µg de D-cloprostenol por vía IM (prostaglandina Emefur, Merial Argentina S.A.). En el Día 9 fueron inyectadas con 10,5 µg de GnRH (acetato de buserelina, Rosenbusch, Argentina) y fueron inseminadas. Las vaquillonas del grupo GnRH 5 d en el Día 1 fueron inyectadas IM con 10,5 µg de GnRH (acetato de buserelina, Rosenbusch, Argentina) junto con la aplicación de un dispositivo intravaginal de 0,6 gr de progesterona (Emefur Monouso, Merial Argentina S.A.). En el Día 6 se removieron los dispositivos y se administró 150 µg de D-cloprostenol por vía IM (prostaglandina Emefur, Merial Argentina S.A.). En el Día 9 fueron inyectadas con 10,5 µg de GnRH (acetato de buserelina, Rosenbusch, Argentina) y fueron inseminadas. DINÁMICA OVÁRICA: Todas la vaquillonas fueron examinadas por ultrasonografía transrectal (Chison 500, modo B, transductor lineal 5 MHz) para evaluar la dinámica folicular. Ambos ovarios fueron ecografiados diariamente desde el Día 0 hasta el Día 8 (excepto el Día 2) para luego intensificarlas cada 12 h a partir del Día 9 hasta la ovulación (Días 9, 10 y 11, examinación AM PM). Para esto se realizó un mapeo de ambos ovarios de cada vaquillona y fundamentalmente se evaluó: sincronización en la emergencia de ondas de desarrollo folicular, formación de cuerpos lúteos (CL), formación de CL accesorios, regresión luteal y ovulación. Para ello siempre se tomaron 2 medidas (alto y ancho) de cada estructura (CL o folículo) y se promedió entre ambas para obtener una medida más aproximada. 6

7 DETECCIÓN DE CELOS: Los celos fueron observados visualmente en los momentos previos a las ecografías y además se utilizó pintura en la base de la cola como método de ayuda. Las detecciones se realizaron 24 h después del retiro del Dispositivo intravaginal, una vez por la mañana y una vez por la tarde (Días 7, 8 y 9). INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Y DIAGNÓSTICO DE GESTACIÓN: Las vaquillonas de ambos grupos fueron inseminadas artificialmente a tiempo fijo (IATF) en el Día 9 (72 h posteriores a la PGF para ambos grupos). Para la IATF se utilizó semen congelado/descongelado de un solo toro y fueron inseminadas por un mismo técnico. El diagnóstico de preñez se determinó por medio de ultrasonografía a los 30 días post IATF (Chison 500, modo B, transductor lineal 5 MHz). Todas las vaquillonas preñadas fueron confirmadas nuevamente el Día 86 post IATF por medio de palpación rectal, para determinar posibles pérdidas embrionarias y/o fetales. ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Para analizar el efecto tratamiento sobre el diámetro folicular ovulatorio, ovulación a la 1 dosis de GnRH, crecimiento folicular, inicio de onda y momento de ovulación se utilizó ANOVA, mientras que para analizar tasa de ovulación y tasa de preñez se utilizó Test de proporción. RESULTADOS: Dos vaquillonas del grupo BE 6 d fueron descartadas al segundo Día de la evaluación ecográfica por lesiones rectales, aunque al final del tratamiento fueron inseminadas con el resto de las vaquillonas. La tasa de ovulación a la primera dosis de GnRH para el grupo GnRH 5 d fue del 50 % (7/14), comenzado una nueva onda de desarrollo folicular 1,5 días luego de su 7

8 administración (Tabla 1). Las vaquillonas que no ovularon a la primer GnRH tuvieron un inicio de onda con un rango que varió entre 1 a 4,5 días. En el grupo BE 6 d 11/12 vaquillonas (91,6%) iniciaron una nueva onda de desarrollo folicular entre 2 a 5 días posteriores a la inserción del dispositivo y a la administración de BE, con una mayor proporción de animales comenzado en el Día 4 (5/12). Cuando se compararon ambos grupos, hubo una diferencia significativa (P < 0,05) en el inicio de onda, siendo el tratamiento BE 6 d más sincrónicas en sus emergencias de onda (Tabla 1). La tasa de ovulación al final de los tratamientos no difirió significativamente entre los grupos (P > 0,05). Estas fueron de 91,6 % (11/12) y 92,8 % (13/14) para los grupos BE 6 d y GnRH 5 d, respectivamente (Tabla 1). Las ovulaciones se distribuyeron entre las 60, 72, 84, 96 y 108 horas post remoción del dispositivo, con porcentajes de 9%, 9%, 9 %, 9% y 63% respectivamente para las vaquillonas del grupo BE 6 d. En el grupo GnRH 5 d fueron entre las 72, 84, 96 y 108 horas post retiro del dispositivo con porcentajes de 7,6 %, 30,7 %, 23 % y 38,4% respectivamente para cada horario. No hubo diferencias significativas entre ambos grupos para las distribuciones de ovulación (P > 0,05) (Figura 2). Las horas medias de ovulación tampoco difirieron entre ambos grupos, siendo 97,09 ± 5,23 h y 95,07 ± 3,45 h para los grupos BE 6 d y GnRH 5 d respectivamente (P > 0,05) (Tabla 1). Sólo 8/14 (57 %) animales del grupo GnRH 5 d fueron observados en celo, mientras que 6/14 (43%) fueron observadas en el grupo BE 6 d (Figura 3) (P > 0,05). Una vaquillona del grupo BE 6 d fue observada en celo 36 h post retiro del dispositivo ovulando 24 h más tarde (60 h post remoción del dispositivo) (Figura 3). Esta no resultó preñada el día 30 post IATF al diagnóstico ultrasonográfico. El crecimiento folicular fue similar entre ambos grupos (Figura 4). No se observaron diferencias significativas entre tamaño máximo de folículo ovulatorio (12,03 ± 0,45 mm para GnRH 5 d vs 11,68 ± 0,22 mm para BE6 d) (P > 0,05). De todas maneras hubo una diferencia numérica a favor del grupo GnRH 5 d (diferencia 0,35 mm) (Tabla 1). Respecto al grupo GnRH 5 d, las vaquillonas que ovularon a la 1 dosis de GnRH tuvieron en promedio un diámetro folicular numéricamente mayor, aunque no se encontraron diferencias significativas entre ambas (12, 21 ± 0,32 mm para las que ovularon a la 1 GnRH vs. 11,83 ± 0,95 mm para las que no ovularon a la 1 GnRH - P> 0,05). 8

9 Las tasas de concepción a los 30 días de la IATF no difirieron entre sí (P > 0,05). Para BE 6 d fue del 50 % (7/14) mientras que para GnRH 5 d fue del 57 % (8/14). De las vaquillonas que manifestaron celo, 7 de 8 vaquillonas del tratamiento GnRH 5 d (P <0,05) y 5 de 6 vaquillonas del tratamiento BE 6 d (P >0,05) fueron diagnosticadas preñadas a los 30 días (Tabla 2). Todas las vaquillonas preñadas (7/14 grupo BE 6 d y 8/14 grupo GnRH 5 d) mantuvieron la preñez cuando fueron reexaminadas por palpación rectal 86 días post IATF. Tabla 1- Inicio de ondas foliculares, diámetros medios de folículos dominantes ovulatorios, porcentajes de ovulación y horas medias de ovulación para los tratamientos BE 6 d y GnRH 5 d en vaquillonas de 16 a 17 meses BE 6 d GnRH 5 d Nº de animales 12/12 14/14 Inicio de onda (días) Mediana 4 a 1,5 b Rango 2 5 a 1 4,5 b (P < 0,05 ab) Diámetro FD OV 11,68 ± 0,22 c 12,03 ± 0,45c (mm) Rango 11-13,5 9,5 16 (P > 0,05 c) % Ovulación 91,6 (11/12)d 92,8 (13/14)d (P >0,05 d) Hora media OV 97,09 ± 5,23 e 95,07 ± 3,45 e (horas) Desvío Estándar 17,35 e 12,45 e (P > 0,05 e) - a b hubo diferencias significativas (P = 0,0004). - c d e no hubo diferencias significativas (P>0,05) 9

10 Tabla 2 Vaquillonas preñadas a los 30 días post IATF con o sin manifestación de celo previo a la inseminación y tasa de preñez para los tratamientos BE 6 d y GnRH 5 d Grupo Con celo Sin celo TOTAL % Preñez BE 6 d 5 / 6 a 2 / 8 a 7 / % (n = 14) GnRH 5 d 7 / 8 b 1 / 6 b 8 / % (n=14) TOTAL 12 / 14 c 3 / 14 c - a no hubo diferencias significativas (P> 0,05) - b hubo diferencias significativas (P = 0,03) - c hubo diferencias significativas (P = 0,002) 10

11 Figura 2 - Distribución de las ovulaciones en vaquillonas de meses tratadas con BE 6 d y GnRH 5 d desde la remoción de los dispositivos intravaginales (en horas) hasta el momento de ovulación. (P > 0,1 no hubo diferencias significativas). - Las preñeces logradas se muestran en cada uno de los respectivos horarios de ovulación. Para las vaquillonas del grupo BE 6 d las preñeces fueron 1 para las 72 h de ovulación (Ov), 1 para las 96 h de Ov y 4 para las 108 h de Ov; mientras que para el grupo GnRH 5 d fueron 4 para las 84 h de Ov, 3 para las 96 h de Ov y 1 para las 108 h de Ov. Figura 3 - Distribución de celos en vaquillonas de grupos BE 6 d y GnRH 5 d. (P>0,05 no hubo diferencias entre grupos) 11

12 Figura 4 - Crecimiento medio de folículos dominantes en protocolos BE 6 d y GnRH 5 d desde el inicio de la onda folicular hasta alcanzar sus diámetros medios preovulatorios en vaquillonas (P > 0,05 no hubo diferencias significativas entre grupos). - Días 5 y 6 fueron los días de retiro de dispositivos y se aplicó 150 µg de D-Cloprostenol IM para los grupos GnRH 5d y BE 6 d respectivamente. - Días 8 y 9 fueron los días en los que se administró por vía IM 10,5 µg de GnRH (acetato de Buserelina) y se realizó la IATF para los tratamientos GnRH 5 d y BE 6 d respectivamente. DISCUSIÓN: Este trabajo fue diseñado para comparar dos tratamientos de IATF y evaluar su eficacia en la sincronización de la emergencia de una onda de folículos, a partir de una cohorte y su subsiguiente ovulación. Ambos protocolos demostraron ser efectivos para sincronizar vaquillonas para carne de entre 16 y 17 meses de edad. Varios autores determinaron que con el uso de BE por vía IM y Progesterona en dispositivos intravaginales, aplicados en vacas en distintos estadíos fisiológicos, regresaban los folículos dominantes (FD) presentes, iniciando una nueva onda de desarrollo folicular 4 días más tarde, sin precisar el momento del ciclo estral en que se encontraban (Caccia and Bo, 1998, Moreno et al., 2001). En el presente ensayo, las 12

13 vaquillonas que recibieron el tratamiento BE 6 d se sincronizaron e iniciaron su onda en un rango de 2 a 5 días, con una mayor cantidad de animales iniciando en el Día 4. En el grupo GnRH 5 d, sólo el 50% de las vaquillonas ovularon a la 1º dosis de GnRH. Estos resultados no difirieron de trabajos anteriores, realizados en vaquillonas, en los que se lograron similares porcentajes (Pursley et al., 1995, Martínez et al., 2000), comenzado una nueva onda folicular 1,5 días más tarde (Martínez et al., 2000). Bridges, et al. (2009) reportaron que con protocolo CO-synch con CIDR por 5 días en vacas de carne, era necesario administrar dos dosis de PGF con un período de 12 h entre inyecciones, para producir luteolisis de cuerpos luteos accesorios generados por la ovulación a la 1º dosis de GnRH. En vaquillonas lecheras también fue reportada la utilización exitosa de estos tratamientos, aunque fue necesaria una sola dosis de PGF para producir luteólisis en el momento de retirados los dispositivos intravaginales (Rabaglino et al., 2010). En este trabajo se hipotetizó que en vaquillonas para carne sería suficiente también una única dosis de PGF para lisar los CL accesorios. Al analizar lo ocurrido en este experimento, pudo observarse regresión luteal de todas las vaquillonas que ovularon a la 1º GnRH en el tratamiento GnRH 5 d; al menos hubo una considerable disminución en los tamaños de los CL accesorios y en algunos casos desaparición de los mismos a la examinación ultrasonográfica. Si bien, deberían realizarse en el futuro estudios que determinen la funcionalidad de estos CL en proceso de regresión, y su consecuente secreción de progesterona se puede pensar que al ovular la mayoría de las vaquillonas la PGF fue efectiva en la inducción de la regresión luteal. La madurez folicular ha sido relacionada tradicionalmente con tamaño folicular. Tal es así, que la inducción de la ovulación mediante GnRH de folículos 11 mm, resultaron en bajas tasas de preñez e incremento de muertes embrionarias/fetales tempranas (Perry et al., 2005). Esta disminución se asocia a una baja concentración de estradiol en el día de la inseminación artificial (IA) y baja concentración de progesterona después de la IA; excepto en folículos ovulatorios que ovulan espontáneamente (Perry et al., 2005). La ovulación prematura de un folículo dominante con GnRH, redujo el tamaño del folículo ovulatorio, la fertilidad y la función luteal (Mussard et al., 2007). Además, recientemente se informó que la madurez folicular asociada a la fertilidad en ganado bovino es multifactorial y no está predeterminada por una sola característica (Bridges et al., 2010). La acumulación de efectos como la duración del proestro, la producción de estradiol durante el proestro, el diámetro folicular, la edad folicular y la producción de progesterona por el CL resultante, serían 13

14 parte de los factores involucrados (Bridges et al., 2010). También se demostró que las ovulaciones resultantes de vacas de tratamientos CO-synch + CIDR de 5 días, que no responden a la 1º dosis de GnRH, producen mayores picos de estradiol a partir de sus folículos dominantes, resultando en mayores concentraciones de progesterona durante sus subsiguientes fases luetales. (Bridges et al. 2009) En las vaquillonas de ambos grupos, no hubo diferencias significativas entre los diámetros de los folículos ovulatorios, edad folicular, ni tampoco en el momento y hora media de ovulación. En el trabajo de Bridges, et al. (2010) mencionado en líneas anteriores, se informó que un proestro largo (2,2 días) tendría más posibilidades de lograr preñez en comparación con un proesto de corta duración (1,2 días). Las tasas de preñez fueron mayores con un proestro largo (50 %) compradas con un proestro corto (2,6%). Sin embargo, otros autores (Wilson et al., 2010) sostienen que el efecto de prolongar el proestro no solo favorece las tasas de concepción de protocolos CO-synch +CIDR de 5 días con IATF a las 72 h, sino que también produciría el mismo efecto con los protocolos CO-synch + CIDR de 7 días con IATF a las 66 h, ya que en este trabajo no existieron diferencias significativas cuando se compararon las tasas de preñez de ambos tratamientos. Si bien el presente ensayo no tuvo como objetivo determinar los efectos de los tratamientos sobre los porcentajes de concepción, es destacable que las tasas de preñez logradas fueron aceptables (BE 6 d 50 %, GnRH 5d 57 % -P>0,05), y más aún, considerando el grado de estrés al que fueron sometidas las vaquillonas al ser evaluadas diariamente mediante ultrasonografía. En el futuro deberían realizarse más estudios para determinar tasas de preñez en un número mayor de animales y poder ajustar el momento de IATF de estos tratamientos en rodeos de vaquillonas productoras de carne. CONCLUSIÓN: Ambos tratamientos demostraron ser eficientes para la sincronización de emergencias de ondas foliculares y sus resultantes ovulaciones en programas de IATF, para vaquillonas de razas de carne de entre 16 y 17 meses de edad. Aunque el objetivo del presente trabajo no fue evaluar las tasas de preñez, se concluye que ambos protocolos resultan en aceptables tasas de concepción. 14

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