Genomas, contenido de genes.
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- Hugo Sánchez Rico
- hace 8 años
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2 Genomas, contenido de genes.
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9 REGULACION DE LA EXPRESION GENICA -Donde, cual, cuanto, cuando, se expresa la información génica? -Elementos cis- y transregulatorios -Operon lac Jacob Monod, - regulación positiva y negativa, represión por catabolito -Regulación en eucariotas - elementos cis, función de un enhancer - elementos trans, factores de transcripción, cofactores -Características de hetero- y eucromatina, -regulación por modificaciones epigeneticas -Métodos de análisis funcional de secuencias regulatorias - in silico, in vitro, in vivo, gen reportero Dr. G.Kausel, 2009
10 ESTRUCTURA de un GEN promotor codificante 5 -notraducida 3 -notraducida intergenico DNA Sitio de entrada de la RNA polimerasa Inicio transcripción Sitio de entrada de la ribosoma Inicio traducción termino transcripción termino traducción RNA proteina Dr. G.Kausel, 2009
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12 Análisis in silico para la predicción de secuencias cis-regulatorias Secuencias de consenso en la región promotora predice sitios de unión de factores de transcripción Dr. G.Kausel, 2009
13 En procariotas: En procariotas el factor sigma determina cual, donde y cuando se transcribe un gen Lodish, 10.1 Dr. G.Kausel, 2009
14 REGULACION -Estudiado en procariotas en el operon lactosa -modelo: OPERON, Francoise Jacob y Jaques Monod Mutantes constitutivos y mutantes no-inducibles Dr. G.Kausel, 2009
15 EXPRESION en PROCARIOTAS - transcripción y traducción espacial y temporalmente acoplada - mensajeros policistronicos - la síntesis de varios proteínas está bajo control de un promotor PROMOTOR +1 gen 1 gen 2 gen un mrna policistrónico Varias proteínas Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3
16 REGULACION NEGATIVA REGULACION POSITIVA El gen está en OFF por un represor unido al operador y se activa por sacar el represor El gen está en OFF y se activa por que se une un activador Dr. G.Kausel, 2009
17 E. coli sintetiza tres proteínas para utilizar lactosa como fuente de energía entra lactosa a la célula bacteriana lactosa permeasa galactosidasa: Una pequeña parte de lactosa se transforma en alolactosa (el inductor que saca el inhibidor del operador) -galactosidasa galactosa glucosa alolactosa La -galactosidasa cataliza la digestión a galactosa y glucosa acetilasa no se sabe bien su rol
18 Regulación por elementos cis (secuencias) y elementos trans (proteínas regulatorias) OPERON lactosa gen represor/inductor I represor 1040bp PROMOTOR P operador O genes estructurales lacz lacy laca -galactosidasa 3072bp permeasa 1251bp acetilasa 609pb CAP CAP: catabolite activating protein RNA Pol Repressor
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20 La secuencia cis-regulatoria del lac-operon Alberts, Jacob y Monod (1962) estudiaron mutantes que constitutivamente utilizan lactosa y revelaron la regulación del operon de la lactosa en E. coli. tss
21 La lactosa saca el represor del operador y solamente cuando no hay glucosa se transcribe el operon-lac I P O Z Y A represor/inhibidor alolactosa 1.) cuando no hay lactosa, la célula no transcribe los genes del operon-lac, el represor está unido al operador, que inhibe la unión de la RNA polimerasa al promotor 2.) cuando hay lactosa, la lactosa (alolactosa) se une al represor y el represor ya no está en el operador 3.) cuando hay glucosa y lactosa, la célula prefiere usar glucosa la presencia de glucosa reprime la degradación de la lactosa = represión por catabolito 4.) cuando no hay glucosa aumenta la concentración del camp, el camp se une a una proteína (CAP) y estimula la unión de la RNA Pol al promotor transcripción del operon-lac
22 Estructura de un gen Eucariotico
23 GEN EUCARIOTICO tss: transcription start site Dr. G.Kausel, 2009
24 mrna maduro
25 POSIBLES PUNTOS DE CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Dr. G.Kausel, 2009
26 Inicio de Transcripción
27 TRANSCRIPCION POL II en EUCARIOTAS Dr. G.Kausel, 2009
28 secuencias cis-regulatorios en promotor eucariota Dr. G.Kausel, 2009
29 FUNCION DE UN ENHANCER Secuencia enhancer puede ubicarse río arriba (5 ) o rio abajo (3) o detro del gen para modular la expresión
30 FACTORES DE TRANSCRIPCION Elementos trans-regulatorios Proteínas regulatorias: diseño modular región transactivadora + región unión al DNA Ej: - homeobox - leucin zipper - dedos de zinc
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33 TIPOS DE MOTIVOS DE UNION AL DNA Ej.: el motivo helice-vuelta-helice se encuentra en el dominio homeobox, el dominio de unión al DNA
34 Secuencias especificas pueden ser reconocidas sin que se abren las hebras complementarias, de afuera en el surco mayor y menor Dr. G.Kausel, 2009
35 El dominio homeo de 60 aá está codificado en el homeo-box de 180 bp el homeodominio, que contienen el motivo helice-vuelta-helice, se compone de 60aa codificado por 180bp homeo-box, altamente conservada, presente en multiples proteinas regulatorios como los factores de transcripcion con homeo-box, ej. genes hox en eucariotas, que determinan eje anterior-posterior Wolberger et al., Cell 67: , 1991
36 Otro tipo de motivo de unión al DNA: DEDOS DE ZINC zinc-finger Ej.: fragmento del receptor de glucocorticoide Células detectan y responden a nivel transcripcional a hormonas glucocorticoides que están producidos por la glándula adrenal en respuesta al estrés Luisi et al., Nature 352: , 1991
37 INTERACCION PROTEINA-PROTEINA proteínas regulatorias que no se unen directamente DNA se llaman co-activador o co-represor esta proteína participa en complejos activadoras y represoras
38 Transcripción y procesamiento
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47 Edición del RNA: Editing
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54 EPIGENETICA PATRON HEREDABLE DE LA ACTIVIDAD DE GENES QUE NO IMPLICA CAMBIOS A NIVEL DE NUCLEOTIDOS, SI NO MEDIANTE EL ESTADO DE ORGANIZACION DEL DNA (ESTRUCTURA DE LA CROMATINA) -Modificación química del DNA (metilación) -Modificación química de las proteínas histonas (acetilación, metilación, fosforilación, poliadenilación) - Unión de otras proteínas al DNA Regulación del aceso a ser transcrito Dr. G.Kausel, 2009! Efecto ambiental!
55 IMPORTANCIA DE LA METILACION DEL DNA -en mamíferos en dinucleotidos CpG -involucrado en funciones importantes como - impronta - inactivación de la cromosoma X - silenciamiento de retrotransposones - inactivación de genes de tumores - regulación de la expresión génica en embriones Heterocromatina DNA no acesible, no activa Eucromatina DNA acesible, activa Dnmt1 = mantención-mt; Dnmt3a y b = de novo MT
56 Informacion adicional Dr. G.Kausel, 2009
57 Estudios de todos los transcritos en un momento en un lugar Transcriptomics Distintos genes en un tejido en diferentes momentos No transcritos Verde: ++++ Rojo: - Un gen en distintos tejido
58 Estudios de todas las proteínas en un momento en un lugar Proteomics En cerebro humano En hígado humano Cada punto es una proteína Separación de proteínas por electroforesis bi-dimensional (1. pi; 2. tamaño)
59 La actividad de la β-galactosidasa se visualiza con X-gal -Región regulatoria 5 y gen lacz -galactosidasa, inductor in vivo: (allo)lactosa, in vitro: IPTG -actividad del gen lacz con sustrato X-Gal produce producto color azul - -galactosidasa activa en presencia de X-Gal, IPTG AZUL - -galactosidasa inactiva en presencia de X-Gal, IPTG sin color unión irreversible al represor X-gal
60 Gen reportero GFP en rana transgénica bajo control de un promotor tejido-expecífico, que dicta la expresión del gen en el ojo Expresión in vivo del gen reportero GFP en ojo Aequorea victoria GFP Gen green fluoreszent protein GFP Dr. G.Kausel, 2009
61 GEN REPORTERO Región regulatoria modula expresión de secuencia codificante gen reportero -In vitro: estudio promotor: inducción de la expresión gen reportero (fold-induction) transfección de constructos en líneas celulares, evaluar expresión gen reportero ej: - gen lacz -galactosidasa reacción colorimetrico - gen luciferasa con sustrato luciferin reacción colorimetrico -in vivo: ej: - gen green fluorezcence protein detección in vivo, cualitativo Dr. G.Kausel, 2009
62 PRINCIPIO DE LA APLICACIÓN DE RNA ANTISENTIDO oligonucleotidos antisentido específicos se incorporan a la célula, hibridan con el mrna específico y bloquean la síntesis de la proteína estudio del efecto al fenotipo indica la función
63 INTERACCION PROTEINA/DNA footprinting Ej: Dr. G.Kausel, 2009
64 INTERACCION PROTEINA/DNA in vivo Chromatin immune precipitation ChIP Cross-link de las células con formaldehido lisis de las células romper cromatina inmunoprecipitación revertir el cross-link eliminar proteínas y limpiar DNA amplificar secuencia especifica La inmunoprecipitacion puede ser ej. con anticuerpo contra histona, histona modificada o factor de transcripción especifico Dr. G.Kausel, 2009
65 INTERACCION PROTEINA/DNA in vitro EMSA electromobility shift assay DNA marcado radiactivmente Extracto nuclear Fraccionamiento en geles de poliacrilamida y retardo del complejo DNA/proteína Dr. G.Kausel, 2009
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-Concepto operon -Mutante constitucional -Lac operon, represor (alolactosa), regulacion por represion catabolito -Promotor (pro. Policistronico, eu. Pol II con TF) -Elementos cis- y trans-regulatorios,
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