Práctico: Genética bacteriana 2007.

Transcripción

1 Práctico: Genética bacteriana Actividad integrada Departamento de Genética Departamento de Bacteriología y Virología. OBJETIVOS Objetivos generales El estudiante al terminar la actividad práctica podrá reconocer y describir: 1- Diferentes mecanismos de intercambio de información genética entre bacterias. 2- Métodos de caracterización genética que permiten la comparación de cepas bacterianas. 3- Aplicaciones directas para la medicina del estudio genético de las bacterias (epidemiología, prevención, terapéutica, diagnóstico). Objetivos específicos Evidenciar la presencia de un gen por observación de características fenotípicas de una cepa bacteriana (capacidad para multiplicarse en presencia de un antibiótico). Evidenciar un mecanismo de regulación de la expresión génica (operón lactosa en acción) y comprender sus aplicaciones para la expresión regulada de genes heterólogos. Observar e interpretar métodos fenotípicos y genotípicos para el análisis de los genes y genomas. METODOLOGÍA Los objetivos planteados se alcanzarán por medio de: - Discusión basada en la observación de cultivos de una cepa de E. coli, la misma cepa que ha sido transformada en el laboratorio con un plásmido en distintas condiciones de selección. - Realización de una corrida electroforética en gel de agarosa del producto de amplificación de PCR específica para un fragmento del plásmido transformado. - Observación e interpretación de los resultados de la electroforesis - Observación e interpretación de los productos de la restricción enzimática del mismo plásmido luego de electroforesis en gel de agarosa.

2 Actividades 1- Discusión al respecto de los posibles mecanismos responsables de variación de la expresión génica en las bacterias, refiriéndose como guía para la discusión a la adquisición de un fenotipo de resistencia a un determinado antibiótico (por ejemplo a Ampicilina) por parte de una cepa bacteriana. 2- Observación de cultivos de una cepa de E. coli de laboratorio y de la misma cepa transformada con un plásmido que confiere resistencia a ampicilina o transformada con el mismo plásmido al que se le ha clonado un gen eucariota. Estos cultivos se observarán en placas de LB, LB/ampicilina y LB/ampicilina/IPTG/X-gal. 3- Observación de fotografías/esquemas del producto de restricción de este plásmido con y sin inserto e interpretación del mapa del plásmido. 4- Discusión para definir un protocolo de PCR para identificar cuales colonias contienen el plásmido con inserto y cuales no. 5- Realización de una corrida electroforética con estos productos de PCR y observación de un gel previamente teñido. 6- Discusión al respecto de aplicaciones de PCR/ restricción enzimática/ análisis de DNA plasmídico/clonación/transformación para la epidemiología, diagnóstico, terapéutica, prevención 7- Discusión final grupal tendiente a asegurar el cumplimiento de los objetivos. Información para la discusión en subgrupos 1)Extracción de plásmidos y su uso como vectores de información El ADN de una cepa bacteriana, puede ser extraído de las células por diferentes procedimientos y puede separarse el ADN cromosómico del plasmídico. Con un extracto de ADN plasmídico, puede realizarse una corrida electroforética y visualizarse lo que se denomina el perfil plasmídico de una cepa bacteriana. Este procedimiento tiene gran aplicación fundamentalmente en epidemiología. A partir de plásmidos obtenidos en el laboratorio, ya sea provenientes de una cepa o construidos artificialmente, es factible transferir información genética contenida en estas moléculas a una cepa bacteriana. Este procedimiento se denomina transformación, y consiste en forzar a una cepa a captar de alguna forma el ADN extraño. Esta captación es en general más eficiente cuando el ADN a incorporar se encuentra como una molécula circular cerrada, por lo que los plásmidos son moléculas ampliamente utilizadas para transferir información de una cepa a otra en el laboratorio. También las bacterias en la naturaleza, utilizan la transferencia de ADN plasmídico como método habitual para intercambiar material génico, aunque muchas veces está mediado por contacto entre una célula dadora y una receptora (conjugación).

3 Fig.1 Mapa de un plásmido modificado utilizado como vector de clonado. 2) Selección de plásmidos recombinantes por alfa-complementación, utilizando IPTG y X-gal El IPTG (isopropil-beta-d-tiogalactosido) es un análogo de la lactosa que no puede ser utilizado como fuente de carbono o energía por las bacterias. Cuando es agregado al cultivo de una bacteria que posee el operón lac, actúa inactivando al represor lacz y por lo tanto induce la transcripción del operón lac. E. coli sintetiza una beta-galactosidasa que es capaz de hidrolizar el disacárido lactosa en los monosacáridos glucosa y galactosa. La actividad de esta enzima puede ser puesta en evidencia utilizando un sustrato cromogénico como el X-gal (5-bromo 4-cloro 3-indolil beta D galactósido) el cual es convertido por la beta galactosidasa en un compuesto azul insoluble. Muchos vectores plasmídicos comúnmente usados en el laboratorio para el clonado de genes de interés (puc, Bluescript, pgem etc) portan un segmento del DNA de E. coli conteniendo la secuencia regulatoria y la información codificante para los primeros 146 aminoácidos de la beta galactosidasa. Incluida en esta región del plásmido se encuentra el sitio de policlonado del vector, que mantiene el marco de lectura y resulta en la incorporación de unos pocos aminoácidos a la secuencia de la beta galactosidasa. Este tipo de vectores pueden ser utilizados en cepas de laboratorio que expresan la porción carboxi-terminal de la beta galactosidasa. Una cepa de este tipo de por si sola no podrá expresar la enzima, pero cuando es transformada con el plásmido, la beta galactosidasa podrá sintetizarse de forma completa de manera de ser enzimáticamente activa. Este tipo de complementación, en el cual las mutaciones por deleción del segmento proximal del gen lacz son complementadas por mutantes beta galactosidasa negativos que poseen la porción proximal de lacz intacta, es llamada alfa-complementación.

4 Las bacterias lac+ que resultan de esta alfa-complementación, son fácilmente reconocidas en presencia del sustrato cromogénico X-gal, observándose de color azul. La inserción de un fragmento de DNA exógeno en la zona de policlonado del vector resultará en la producción de una subunidad de beta galactosidasa que no será capaz de complementar la actividad enzimática, por lo que las colonias portadoras del plásmido conteniendo el inserto no serán capaces de metabolizar el sustrato cromogénico y se observarán incoloras en los cultivos. Este método permite el screening de varios miles de colonias transformantes para encontrar alguna que haya incorporado una copia del plásmido recombinante. Hay que considerar que el método de selección no es infalible, ya que existe la posibilidad de que la inserción no inactive la capacidad de complementación (sobre todo cuando se trata de insertos menores de 100pb que no cambian el marco de lectura) y que no todas las colonias blancas porten plásmidos recombinantes. Para corroborar que las colonias seleccionadas poseen el inserto de interés es necesario extraer el DNA plasmídico y corroborar por restricción enzimática y/o PCR específica la presencia del inserto. Fig.2. Esquema del sistema de alfa complementación en E.coli.

5 Fig. 3. Esquema de una estrategia típica de clonado en un plásmido. A. Digerir blanco y plásmido con una misma enzima de restricción B. Ligar ADN blanco y plásmido. C. Transformar células bacterianas con el producto de ligación D. Selección de colonias

6 3) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Esta técnica consiste en la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN, imitando el proceso de replicación del ADN celular. Se basa en el uso de oligonucleótidos (primers o cebadores) que son complementarios a las secuencias que delimitan el fragmento que se quiere amplificar. Es una técnica con alta sensibilidad y especificidad que permite a partir de unas pocas moléculas de un ADN molde, amplificar millones de veces un fragmento de interés para que pueda ser visualizado. Utiliza una ADN polimerasa (generalmente Taq pol.), una mezcla de deoxiribonucleotidos-trifosfato (dntps), un par de cebadores específicos y un buffer que brinda las condiciones iónicas apropiadas para la polimerización. La reacción se lleva a cabo en un equipo (termociclador) que trabaja por ciclos de temperatura: desnaturalización (por ej. 95º), luego de hibridización de los cebadores y por último la temperatura de polimerización a la cual actúa la enzima. Estos pasos se repiten unas 30 veces, aumentando exponencialmente el número de copias de la secuencia blanco. Los fragmentos amplificados podrán ser evidenciados de varias formas siendo la más usada la visualización directa en geles de agarosa mediante tinción con bromuro de etidio reconociendo una banda que corresponde al peso molecular esperado. Otra técnica muy aplicada al revelado de reacciones de PCR, es la hibridización con sondas específicas. Habitualmente se realiza una corrida electroforética y se transfiere el DNA a una membrana de nylon o nitrocelulosa (proceso llamado Southern blot). A la membrana se le agrega una solución de ácido nucleico marcado (sonda) complementario a la secuencia que se quiere detectar. De estar presente la secuencia buscada, la sonda se hibridizará y luego de revelar se detectará una señal que varía según el tipo de marca (por ej. radioactiva o colorimétrica) La PCR es desde hace tiempo una técnica ampliamente utilizada en el laboratorio con fines de investigación, para identificar la presencia o ausencia de regiones precisas tanto en ADN de procedencia eucariota como procariota. Cada vez más se utiliza en el laboratorio clínico, con fines de diagnóstico fundamentalmente. 4)Corrida electroforética de ADN en gel de agarosa La electroforesis es una técnica que permite separar distintos fragmentos o moléculas de ADN en función de sus pesos moleculares y/o de su conformación (circular superenrrollada, circular relajada o lineal). El DNA a ph neutro está cargado negativamente por lo que migra hacia el polo positivo cuando es sometido a un campo eléctrico. La distancia recorrida esta en relación inversa con el tamaño del ADN, por lo que las moléculas pequeñas migrarán más que las de mayor tamaño. Las moléculas de ADN circular como los plásmidos pueden encontrarse en distintas conformaciones con diferente movilidad electroforética. Preparación del Gel Según el tamaño de las moléculas de ADN que se van a estudiar, se preparará el gel con diferentes concentraciones de agarosa. El buffer a utilizar en la corrida electroforética es el mismo utilizado para diluir la agarosa. En el práctico se trabajará con agarosa 0,7% en buffer TBE.

7 Se calienta la suspensión agitando, hasta alcanzar el punto de ebullición. Se deja enfriar hasta ºC y se vierte en el portagel conteniendo el peine, hasta un espesor de aproximadamente 0,5 cm. Se deja solidificar unos minutos en una superficie nivelada. Se retira el peine y se coloca en la cuba de electroforesis, la cual se llena con buffer de corrida hasta cubrir la totalidad del gel. Siembra de las muestras Sobre una superficie limpia y lisa, se mezcla un volumen adecuado de la muestra a ensayar (por ejemplo 5 μl de un preparado de DNA plasmídico), con el buffer de muestra (el cual contiene azul de bromofenol que marcará el avance de la corrida electroforética y glicerol para darle consistencia a la muestra facilitando su carga en los hoyos del gel). El buffer a utilizar se encuentra 6 veces más concentrado que la dilución de uso, por lo que deberá diluirse 6 veces en la muestra (por ejemplo 5 ul muestra más 1 ul buffer). Se mezcla bien con micropipeta y se carga el hoyo. Se repite la operación por cada muestra a correr. Corrida electroforética Se cierra la cuba conectando los electrodos y se larga la corrida. Se recomienda en general aplicar un voltaje de hasta 5 voltios por cm (medido entre electrodo y electrodo), por ejemplo, para una minicuba de cm, se trabajará a V. Revelado y observación. Una vez que el frente de corrida ha avanzado lo suficiente, se para la electroforesis, se abre la cuba y se retira el portagel. El gel se sumerge en una solución previamente preparada de Bromuro de Etidio durante unos minutos y se observa el gel en un transiluminador o fuente emisora de luz ultravioleta. Figura 4. Electroforesis en agarosa de DNA plasmídico. Carril 1, marcador de peso molecular. Carriles 2, 4 y 6, DNA plasmídico extraído de distintas colonias, s. Carril 3, 5 y 7, l os mismos plásmidos digeridos con 2 enzimas de restricción.