Investigación en genes. Tecnología del ADN recombinante

Transcripción

1 Investigación en genes Tecnología del ADN recombinante

2 Tecnología del ADN recombinante 1º parte: Conocimientos básicos que posibilitaron su desarrollo 2º parte: Instrumentos básicos 3º parte Ejemplos

3 Conocimientos básicos que posibilitaron el desarrollo de la Tecnología del ADN recombinante I Propiedades de los Acidos nucléicos Complementariedad de bases (construcción de nuevas secuencias, amplificar o detectar) Fuerzas que estabilizan a la doble hélice de ADN Características del Flujo de información genética II Enzimología de Acidos nucléicos Endonucleasas de restricción (cortan) Ligasas (unen) ADN polimerasas (replican) Transcriptasa inversa (transcriben) III Vectores de ADN Fragmentos de ADN (naturales o artificiales) que pueden transportar ADN foráneo. Plásmidos Virus Cósmidos BACs YACs

4 Complementariedad de bases Fuerzas que estabilizan al ADN Estructura: Exterior: Eje azúcar-fosfato con carga negativa e Interior anhidro ) -Interacciones no covalentes (puente hidrógeno entre bases nitrogenadas, Fuerzas de van der Waals entre bases contiguas apiladas) -Efecto hidrofóbico Vista axial (apilamiento de bases) Puentes de hidrógenos que se establecen entre las bases nitrogenadas. Solo es necesario conocer la secuencia de una de las cadenas para deducir la secuencia de la cadena complementaria -Fusión por Tº (rompe puentes H) -Tm: Tº donde se separa la mitad de la doble hebra -Al descender la temperatura la estructura se renaturaliza (annealing o templado)

5 Características del Flujo de información genética ADN ARN Proteínas replicación transcripción traducción Replicación del DNA (Duplicación DNA a DNA) 5 3 Doble hebra de ADN (DNA) n + dntp Cebador o Primer activados DNA polimerasa (DNA) n+1 + PP i

6 Transcripción: de DNA a RNA 3 ADN molde 5 Secuencia de Terminación Promotores de transcripción (DNA) n + n NTP (RNA) n + n PP i activados RNA polimerasa Traducción: de RNA a proteínas

7 II Enzimología de Acidos nucleicos Producción de moléculas de ADN recombinante II Enzimas de restricción Descubiertas por Arber y H Smith Frecuentemente en bacterias Cortan el ADN extraño EcoRV (verde) Sustrato: Reconocen una secuencia de entre 4-8 bp en una molécula de ADN de doble hebra. Rompe un enlace fosfodiéster en ambas hebras Porción de la doble hebra de ADN cuya secuencia es palindrómica o de simetría rotacional binaria Palíndromo: dabale arroz a la zorra el abad Acaso hubo búhos acá?

8 II Enzimas de restricción tipos de cortes: Cortes escalonados, dejando productos con extremos cohesivos Cortes simétricos, dejando productos con extremos romos

9 II Ligasas Forma enlaces covalentes entre el extremo 5 de una cadena polinucleotídica y el extremo 3 de otra cadena polinucleotídica.

10 II Enzimología de Acidos nucléicos Producción de moléculas de ADN recombinante I Enzimas de restricción y ligasas Unión entre fragmentos de DNA con extremos cohesivos Adición de secuencias de restricción a fragmentos de ADN ligasas

11 III Vectores: moléculas de ADN Plásmidos y virus, Cósmidos, BACs y YACs Poseen replicación autónoma Llevan un sitio de origen de la replicación Presenta un sitio de multiclonado o polilinker Poseen genes marcadores que permitan seleccionar las células huéspedes con la secuencia recombinante Se utilizan para clonar un gen (multiples copias idénticas del mismo) (Vectores de clonado) o para expresar una proteína recombinantes (vectores de expresión)

12 III Vectores: Ej: Selección de bacteria con el plásmido recombinante Sal I Sal I Sal I ADN de interés plásmido ligasa ADN recombinante Transformación de bacterias Plaqueo en Réplica para tratamiento con antibióticos Con ambos antibióticos Bacterias muertas (s/plásmido) o Bacterias resistentes a los dos antibióticos (puntos blancos) Con ampicilina Bacterias con plásmido recombinante

13 III Vectores: Ej: Bacteriófago 48 kb del fago no son esenciales para la infección lítica y pueden ser reemplazadas por ADN foráneo

14 III Vectores: Ej: Fago gt- (mutante del fago ) Posee dos sitios de restricción para EcoRI 10 kb

15 Ej: Fago M13 III Vectores: Virus filamentosos que no presenta ciclo lítico Se empaqueta en formas víricas

16 III Vectores: Vectores artificiales. Fueron desarrollados para albergar moléculas de ADN de gran tamaño Cósmidos BACs Cromosomas artificiales de bacterias 45 kb 300 kb YACs Cromosomas artificiales de levadura más de 600 kb YACs

17 Instrumentos básicos de la investigación en genes 1- Análisis de enzimas de restricción 2- Técnicas de Transferencia de ADN y ARN 3- Secuenciación de ADN 4- Síntesis en fase sólida de ácidos nucléicos 5- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

18 I Enzimas de restricción 1 Patrón de fragmentos de restricción 3 Patrón de fragmentos de restricción 2 Virus SV40 Fragmentos de ADN Electroforesis Método capaz de separar macromoléculas de acuerdo sus principales características (tamaño, forma, carga y carga eléctrica) Las moléculas migran al aplicarse un campo eléctrico entre dos electrodos inmersos en una solución

19 2- Técnicas de Transferencia de ADN y ARN Southern Blot o Transferencia de ADN. Permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Se utiliza para separar y caracterizar moléculas de ADN Tratamiento con un alcali

20 3- Secuenciación de ADN Método de interrupción controlada de la replicación (de Sanger) 1 hebra de interés de ADN ADN polimerasa Cebador NTPs ,3 - didesoxi de ATP ,3 - didesoxi de TTP ,3 - didesoxi de GTP ,3 - didesoxi de CTP

21 3- Secuenciación de ADN Electroforesis de ADN 2,3 - dd de ATP 2,3 - dd de CTP 2,3 - dd de TTP 2,3 - dd de GTP 3 GTCGATGATACGACT 5 5 CAGCTACTATGCTGA 3

22 4- Síntesis en fase sólida de ácidos nucléicos Adición secuencial de monómeros activados a una cadena en crecimiento unida a un soporte sólido.

23 5- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Mezcla de reacción - Fragmento de ADN que se quiere amplificar -ADN polimerasa (de organismo termófilo) -Cebador (complementario de secuencias colindantes) -4 dntps Origen de la Taq La enzima Taq polimerasa fue aislada (1976) de la bacteria Thermus aquaticus, una bacteria que vive en aguas termáles y las enzimas que se extraen de ella son termoestables. Tres Etapas por ciclo 1-Separación de las hebras (94ºC) 2- Hibridación de los cebadores (54ºC) 3- Síntesis de ADN (72ºC)

24 Ventajas de la PCR -Después de n ciclos la secuencia se amplifica 2 n veces -No es necesario conocer la secuencia a amplificar -Se necesita conocer secuencias colindantes -La secuencia a amplificar puede ser mucho mayor que los cebadores PCR Utilidades Diagnóstico clínico Medicina Forense Evolución molecular

25 Ejemplos de Uso de la Tecnología del ADN recombinante A. Producción de moléculas de ADN recombinante B. Biblioteca Genómica C. Recorrido cromosómico D. Control de la Expresión génica E. Manipulación de genes en eucariotas F. Búsqueda de genes de cadn G. Microarreglos de ADN H. Organismos genéticamente modificados

26 A- ADN recombinante Mutagénesis dirigida o mutaciones específicas in vitro 1-Deleciones: Cortes en una secuencia con endo/exonucleasas 2- Sustituciones 3- Inserciones Se pretende sustituir el aminoácido serina por cisteína

27 B- Construcción de una Biblioteca genómica o genoteca: genoteca: colección de clones que contienen el genoma de un organismo completo un gen en una biblioteca genómica

28 C- Recorrido cromosómico

29 E- Manipulación de los genes eucariotas

30 F- Búsqueda de clones de cdna

31 G- Microarreglos de ADN o Chips de genes Soportes de vidrio o siliconas conteniendo miles de moléculas distintas de ADN de hebra simple. Pueden contener : todos los genes de un organismo genes expresados por un tipo celular particular genes seleccionados que uno quiere investigar Sirven para monitorear la expresión de muchos genes simultáneamente

32 G- Microarreglos de ADN

33 chip de ADN (microarray) Células hepáticas normales Células hepáticas cirróticas RNA marcado rojo RNA marcado verde Verde: gen expresado sólo en el hígado cirrótico Blanco: gen no expresado en hígado Rojo: gen expresado sólo en hígado normal. Naranja: gen expresado en hígado normal y cirrótico

34 H- Organismos genéticamente modificados (GMOs) Animales transgénicos -Ratones gigantes -Introducción del gen de la hormona de crecimiento en óvulos fertilizados de ratón -Los ratones que contenían el gen crecían más rápidamente. -Más aún si se les daba de beber agua con cadmio

35 Inserción de genes en células eucariotas Precipitación de ADN ajeno con Fosfato de Calcio Microinyección Infección con retrovirus

36 H- Organismos genéticamente modificados (GMOs) ADN recombinante en vegetales Agrobacterium tumefaciens infecta a la planta e introduce en las células su ADN

37 Las técnicas de la química de ácidos nucléicos y dela química de proteínas se refuerzan mutuamente

38 Algunas estrategias para mejorar la expresión de proteínas recombinantes Regulación de la expresión génica Genes constitutivos: los que se expresan independientemente de las condiciones ambientales Genes regulados: aquellos cuya expresión depende de las condiciones ambientales. A nivel de Transcripción Promotores fuertes (Ej. Promotor del operon Trp) Promotores regulables (Ej. Promotor del operon Lac) A nivel post-transcripcional ARNi: disminuye el nivel de expresión de un gen determinado por mecanismos de ribointerferencia. Hebra de ARN simple que complementa con otra de ARNm y favorece su degradación. Se han descripto tres tipos de ARNi diferentes. A nivel de Traducción Secuencia de Shine Dalgarno (o de unión a subunidad 16s del rrna)