DETECCIÓN DE C. jejuni EN HAMBURGUESA DE POLLO POR PCR TRADICIONAL PRT

Transcripción

1 Página 1 de 5 1. OBJETIVO Detectar la presencia de Campylobacter jejuni en hamburguesa de pollo mediante técnica de PCR. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a muestras de hamburguesa de pollo sospechosa de estar contaminadas con Campylobacter. 3. FUNDAMENTO Los métodos de cultivo tradicionales para identificación de C. jejuni son lentos y tediosos, ya que requieren de aproximadamente 5 días para el aislamiento y caracterización del microorganismo. Por otra parte la diferenciación de C. jejuni de otros microorganismos del mismo género basada en la prueba de hidrólisis del hipurato no siempre permite definir con precisión la identificación, ya que se ha descrito la existencia de cepas de C. jejuni con ausencia de la enzima hipuricasa. A partir de la dificultad de los test fenotípicos para la caracterización a nivel de especie de Campylobacter y el bajo espectro de pruebas bioquímicas, se han desarrollado varios ensayos basados en biología molecular para la identificación específica de este microorganismo La reacción especifica de PCR para amplificación específica de C. jejuni fue desarrollada con el uso de primers según la secuencia nucleotídica de sondas monoespecíficas basadas en el gen altamente conservado gly A (que codifica una serinahidroximetiltransferasa). 4. REFERENCIAS 4.1 Manual de Procedimientos para el Diagnóstico y Caracterización de Campylobacter spp. Difundido a través del IV Curso Avanzado de WHO Global Salmonella Survillance 2006, realizado en el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS Dr. Carlos Malbrán Servicio de Bacteriología Sanitaria Departamento de Bacteriología.

2 Página 2 de 5 5. TERMINOLOGÍA 5.1 ATCC = American Type Culture Collection 5.2 dntps = Desoxirribonucleótidos (adenina, timina, citosina, guanina) 5.3 MgCl 2 = Cloruro de magnesio 5.4 PCR = Reacción en cadena de la polimerasa 5.5 BSA = Serum Albumina Bovine 5.6 pb = pares de base 5.7 TAE= Tris-Acetato-EDTA 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Materiales Materiales de uso común en microbiología (pipetas de vidrio, placas de Petri, asa de inoculación, etc.) 6.2 Reactivos y medios Suero fisiológico en porciones de 250 ml Cepa de Campylobacyter jejuni ATCC Set de partidores específicos Jun F : 5 CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3 Jun R : 5 AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC Reactivos de uso común en PCR tradicional (dntps, Mg Cl2, Taq DNA polimerasa, agua calidad biología molecular, micropuntas, microtubos, micropipetas) Caldo Bolton sin sangre, con suplemento FBP y antibióticos Suplemento FBP (Oxoid SR0232E) Suplemento Skirrow (Oxoid SR0069E) Suplemento Bolton (Oxoid SR 0183E) Suplemento Preston (Oxoid)

3 Página 3 de Caldo Preston sin sangre, con suplemento FBP y antibióticos BSA 0,02% Estándar de peso molecular de100 pares de base (pb) Agarosa calidad biología molecular Buffer TAE 1X Agua calidad biología molecular Solución de bromuro de etidio (1µ/mL) 6.3 EQUIPOS Incubadora regulada a 42ºC ± 1ºC Termociclador Cámara de electroforesis Fuente e poder Microcentrífuga ( x g.) Digitalizador de imágenes Congelador -20ºC 7. DESARROLLO 7.1 Preparación de la muestra, PCR en hamburguesa de pollo Pesar 25 gramos de muestra de hamburguesa de pollo y agregar 250 ml de suero fisiológico estéril. Agitar por 1 minuto y luego dejar en reposo por 15 a 20 minutos Tomar 2 ml del sobrenadante de la solución de lavado del alimento y agregar a 18 ml de caldo Bolton con suplemento FBP y antibióticos Incubar a 42 ± 1 ºC por 18 ± 2 horas en microaerofilia Después de la incubación se toma 1mL del cultivo y se centrifuga a x g durante 10 minutos Luego descartar el sobrenadante Resuspender el pellet en 1 ml de suero fisiológico y centrifugar nuevamente a x g durante 10 minutos.

4 Página 4 de Descartar el sobrenadante Resuspender el pellet en 100 ul de agua calidad molecular Llevar la suspensión por 10 minutos a 100ºC, y luego mantenerla a 4ºC para utilizarla como templado Realizar la mezcla de PCR, según el siguiente esquema: Reactivos Volumen (µl) Concentración Templado 5 Agua PCR 5,75 Buffer 10 X 2,5 1X MgCl 2 50 mm 1 2,0 mm BSA 1% 0,5 0,02g% dntp(mezcla) 2 0,2 mm Jun F 2,5 1 µm Jun R 2,5 1 µm Taq polimerasa 0,25 1,25 U Volumen final Llevar los tubos al termociclador y someter al siguiente programa: Una etapa inicial de desnaturalización de 5 minutos a 94ºC, 2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 64 ºC, 1 minuto a 72ºC, 2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 62 ºC, 1 minuto a 72ºC, 2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 60 ºC, 1 minuto a 72ºC, 2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 58 ºC, 1 minuto a 72ºC, 2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 56 ºC, 1 minuto a 72ºC, Seguido de 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 54ºC, 1 minuto a 72ºC, y una extensión final de 10 minutos a 72ºC. Al final mantener a 4ºC Observar los productos de la reacción de PCR en un gel de agarosa al 2%, corrido a 100 V durante 40 minutos, usando como buffer de corrida TAE 1X y marcador de peso molecular de 100 pares de base. El tamaño de fragmento esperado es de 773 pb C. jejuni. La tinción del gel se realiza con bromuro de etidio (1ug/mL), durante 30 minutos y luego se visualiza bajo una fuente de luz U.V.

5 Página 5 de PCR desde cepa aislada Tomar una asada de cepa desarrollada en agar sangre a 42ºC durante 24 horas en condiciones de microaerofilia y colocarla en un tubo que contenga 1 ml de suero fisiológico, agitar en Vortex Centrifugar a x g durante 5 a 8 minutos. Descartar el sobrenadante y resuspender. El pellet en 200 ul de agua calidad molecular Colocar la suspensión a 100 ºC por 10 minutos, luego colocarla a -20ºC hasta su utilización como templado Realizar la reacción de PCR y la visualización de productos de amplificación de la misma forma descrita en a REGISTROS Identificación del registro Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Registro de Archivador Azul, Libre acceso papel 5 años y disponer identificación de C. Registro de lectura de personal de en la basura jejuni RG informe de resultado microbiología picado en trozos 105 Laboratorio 348 de alimentos 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación 10. ANEXOS 10.1 Registro de identificación de C. jejuni, RG