UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO EN AGUADILLA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS NATURALES. Laboratorio de Genética BIOL 3306

Transcripción

1 UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO EN AGUADILLA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS NATURALES Laboratorio de Genética BIOL 3306 Liza V. Jiménez Rodríguez, Ph.D. Agosto, 2014

2 Pre-prueba I. Pareo 1) Geles de agarosa 2) Loading buffer 3) Kb 4) Geles de acrilamida 5) Running buffer 6) Bromuro de etidio 7) Marcador molecular estándar a. Facilita la conductividad de la corriente b. Luz ultravioleta c. Determinar peso molecular d. Separar moléculas de ácidos nucleicos e. Amortiguador que se le añade a la muestra f. Unidad en que se mide el peso molecular del DNA g. Separa moléculas de proteínas y ácidos nucleicos 2

3 Objetivos Luego de haber completado el ejercicio, el (la) estudiante estará capacitado para: 1. Distinguir entre una electroforesis utilizando geles de poliacrilamida y una electroforesis utilizando geles de agarosa. 2. Describir los diferentes parámetros que influyen en la separación de los fragmentos de DNA. 3. Preparar un gel de agarosa y separar fragmentos de DNA en el mismo. 4. Estimar el peso molecular de los fragmentos de DNA productos de la digestión con endonucleasas de restricción. Introducción Las proteínas y los ácidos nucleicos son moléculas con cargas netas que pueden ser separadas en una matriz gelatinosa utilizando un campo eléctrico. La velocidad con que se mueve una molécula sobre la matriz gelatinosa depende de: 1) los parámetros físicos de la molécula (forma, carga), 2) la fricción de la molécula y la viscosidad del medio, 3) la fuerza del campo eléctrico. En la mayoría de los casos la separación por electroforesis se lleva acabo en geles. Estos geles están formados por unos poros que aumentan el potencial de separación. El tamaño de los poros puede ser controlado por la concentración o el por ciento de soluto que es utilizado para preparar el gel. Mientras más alto el por ciento del gel utilizado más pequeños los poros que se forman y mayor el potencial de separación. La movilidad de cada molécula es inversamente proporcional al logaritmo de su masa. Las moléculas de un tamaño menor que los poros del gel pasan a través de los mismos y llegan al otro extremo del gel. Las moléculas de un tamaño mayor que los poros son casi inmóviles y son observadas cerca de las fosas donde se colocan las muestras. Las moléculas de tamaño intermedio se mueven por el gel con diferentes grados de dificultad (figura 1). Figura 1. Gel de electroforesis. Las moléculas grandes se encuentran cerca del tope del gel y las más pequeña se observan al fondo del gel. 3

4 El gel de electroforesis puede ser preparada de varios materiales, pero los más utilizados son los de agarosa y acrilamida. Ambos geles son porosos y teóricamente cualquiera de ellos puede ser utilizado para separar DNA, RNA o proteínas. Pero como la acrilamida en por cientos bajos es muy delgada y difícil de manipular, es usualmente utilizada en por cientos altos para analizar proteínas y oligonucleótidos pequeños. Los geles de agarosas de por cientos bajos son relativamente rígidos y muy fácil de manipular, y son utilizados para separar moléculas grandes como DNA, RNA y proteínas grandes y complejas. Los geles de acrilamida son corridos verticalmente mientras que los geles de agarosa son corridos horizontalmente (figura 2). En ambos las moléculas se mueven del polo negativo (cátodo) al polo positivo (ánodo). Agarosa Acrilamida Figura 2. Equipo de electroforesis para geles de agarosa y geles de acrilamida. A. Geles de agarosa Aunque los geles de acrilamida pueden ser utilizados para separar con éxito los fragmentos de DNA, los geles de agarosa son utilizados con más frecuencia. El poder de resolución de la agarosa estriba en la cantidad de agarosa utilizada, en el tamaño del poro formado y el hecho de que a un ph de 7, la molécula de DNA posee carga negativa. En la tabla 1 se muestra el rango efectivo de separación en geles de agarosa para las moléculas de DNA lineal. La forma de la molécula de DNA (lineal, circular y súper-enrollada) y el gradiente de voltaje utilizados afectan también la separación de la molécula. El uso de agarosa posee dos ventajas primordiales. La primera es que puede separar fragmentos de DNA con diferencias bien grande en tamaños, desde 70 pares de bases en un gel al 3% hasta 800,000 pares de bases en un gel al 0.1%. La segunda ventaja es que se pueden detectar pequeñas cantidades de DNA (1 ng) si el gel se tiñe con bromuro de etidio. 4

5 Por ciento de Agarosa Rango de separación del DNA lineal (kb) Tabla 1. Rango efectivo de separación de los fragmentos de DNA lineal en geles de agarosa. Las muestras que van a ser colocadas en el gel de agarosa deben ser disueltas en un amortiguador de la muestra ( loading buffer ) para lograr que se muevan a través del gel. Este amortiguador contiene sales (necesarios para mantener la muestras en condiciones óptimas), glicerol (añade peso a las muestras para mantenerlas en el fondo de las fosas) y un tinte como bromofenol azul (ayuda a visualizar el movimiento de las muestras a través del gel). Al gel de agarosa que contiene los fragmentos de DNA se le añade bromuro de etidio. El bromuro de etidio se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA (figura 3) permitiéndonos visualizar las bandas de DNA cuando son iluminadas con luz ultravioleta (figura 4). Figura 3. (a) Molécula de bromuro de etidio. (b) Molécula de bromuro de etidio intercalada entre las bases nitrogenadas del DNA. 5

6 Figura 4. Bandas de DNA en gel de agarosa iluminadas con luz ultravioleta. El bromuro de etidio se puede añadir de varias maneras: 1) a las muestras antes de colocarlas en el gel, 2) al gel mismo cuando esta siendo preparado y 3) al amortiguador de la corrida ( running buffer ) antes de comenzar la electroforesis. Al gel también se le puede añadir bromuro de etidio después que termina la electroforesis. El bromuro de etidio es carcinogénico y mutagénico, por lo que se debe manejar con mucha precaución. B. Estimación del peso molecular El peso molecular del DNA puede ser determinado utilizando la electroforesis en geles de agarosa. Para determinar el peso molecular de los fragmentos de DNA es necesario correr junto a las muestras un marcador molecular estándar. El marcador molecular estándar posee de 5 a 10 fragmentos de DNA a los cuales se le conoce el peso molecular. Existe una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular de las moléculas y la distancia recorrida en el gel. Esta relación permite crear una curva estándar de la distancia de migración versus el log 10 del peso molecular de los fragmento de DNA que se encuentran en el marcador molecular estándar. Esta curva estándar es utilizada para extrapolar el peso molecular de aquellos fragmentos de DNA en estudio. Para crear la curva estándar es necesario: 1) Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del marcador hasta cada una de las bandas observadas en el marcador. Se repite lo mismo con los fragmentos de DNA en estudio. 2) Determinar el log 10 del peso molecular de los fragmentos de DNA que se encuentran en el marcador estándar y trazar en el eje de Y utilizando papel de gráfica regular. 3) Trazar la distancia recorrida en el eje de X. Al terminar la gráfica se observa una línea. 4) Utilizar la distancia recorrida por las muestras y extrapolar a la línea para determinar el peso molecular. 6

7 Materiales Agarosa Amortiguador de la corrida ( Running Buffer, TAE 1X) Amortiguador de la muestra ( Loading Buffer ) Balanza Bandejas para la tinción Bromuro de etidio Caja de electricidad DNA cortado con endonucleasas de restricción DNA sin cortar Hielo Hornillas Lámpara de ultravioleta Lámpara de luz blanca Marcador molecular estándar Matraz de 200 ml Micropipetas Microtubos de 500 µl Papel de aluminio Probeta Puntas de pipetas Regla Sistema de electroforesis para geles de agarosa Procedimiento (Actividad experimental) A. Preparación del gel de agarosa al 0.8% 1. Pese 0.4 g de agarosa y colóquelos en un matraz de 200 ml. Añada 50 ml de amortiguador de la corrida (TAE 1X). 2. Cubra el matraz con un pedazo de papel de aluminio para evitar la evaporación del amortiguador. 3. Coloque el matraz en una hornilla y caliente hasta que toda la agarosa se haya disuelto. 4. Remueva el matraz de la hornilla y déjelo enfriar hasta 60 ºC. 5. Vierta la agarosa sobre la caja de electroforesis. Coloque la peinilla en el extremo de la caja de electroforesis y permita que el gel solidifique. B. Preparación de la muestra. 6. Obtenga dos microtubos de 500 µl y los rotula como CS1 y CS2. 7. En el tubo rotulado CS1 añada 20 µl del DNA que se obtuvo de la escena del crimen cortado con la enzima 1 y 2.5 µl de amortiguador de la muestra 10X ( loading buffer ). 8. En el tubo rotulado CS2 añada 20 µl del DNA que se obtuvo de la escena del crimen cortado con la enzima 2 y 2.5 µl de amortiguador de la muestra 10X ( loading buffer ). 7

8 9. Añada 2.5 µl de amortiguador de la muestra 10X ( loading buffer ) a cada uno de los 4 tubos que preparó en el laboratorio de enzimas de restricción. C. Preparación del tanque de electroforesis. 10. Coloque el gel de agarosa dentro del tanque de electroforesis. 11. Añada el amortiguador de la corrida ( running buffer ) al tanque de electroforesis. Asegúrese de cubrir el gel completamente. 12. Utilizando una pipetta de µl, añada 20 µl del marcador molecular estándar a la primera fosa del gel. 13. Utilizando una pipetta de µl, añada los 20 µl de la muestra en el tubo rotulado CS Utilizando una pipetta de µl, añada los 20 µl de la muestra en el tubo rotulado CS Utilizando una pipetta de µl, añada los 20 µl de la muestra en el tubo rotulado 1. Prosiga de esta manera hasta que coloque todas las muestras hasta el tubo rotulado Coloque la tapa del tanque de electroforesis y conéctela a la caja de electricidad. Verifique que los polos estén correctamente conectados. 17. Corra la electroforesis a 80 V por 1 hora. D. Observación de los resultados 18. Luego de la hora apague la caja de electricidad. 19. Saque el gel de agarosa. Con mucho cuidado colóquelo en una bandeja para tinción y le añade 75 ml del tinte 1X FlashBlueTM. Verifique que el gel se encuentra completamente cubierto por el tinte. 20. Permita que el gel tiña por 5 minutos. 21. Transfiera el gel a una nueva bandeja con ml de agua destilada. Agite la bandeja gentilmente cada 5 minutos. Deje el gel en el agua destilada por 20 minutos. Debe observar bandas azul oscuras sobre un trasfondo azul claro. 22. Con cuidado remueva el gel de la bandeja y examínelo en una lámpara de luz visible. 23. Utilizando una regla mida las distancias entre las fosas y las diferentes bandas observadas. 8

9 Cálculos Utilizando la siguiente hoja de Excel grafique sus resultados. Referencias Bowen R., Agarose Gel Electrophoresis of DNA. Colorado State University, Colorado, USA, Barker, K. At the bench: A laboratory navigator, Updated edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Becker, W. M, Kleinsmith, L. J. and Hardin, J. The World of the Cell, 5 th edition. Benjamin Cummings, San Francisco, Choinski, J. S. Jr. Experimental Cell & Molecular Biology, 2 nd edition. McGraw Hill, Boston, Crandall, E., and Barber, P. Agarose Electrophoresis. Boston University, Boston, USA. Edvoteck. DNA fingerprinting using restriction enzyme. The Biotechnology education company. Experiment 2: Gel Electrophoresis of DNA. Molecular Biology Ciberlab, University of Illinois, Illinois, USA. Pollard, T. D., Earnshaw, W. C. and Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology, 2nd edition. Saunders, New York,

10 Preguntas 1. La forma de la molécula de DNA (lineal, circular y súper-enrollada) afecta la separación de la molécula de DNA Cuál de estas formas de la molécula de DNA se mueve más rápido a través de un gel de agarosa? Por qué? 2. A las muestras de DNA cortado con las endonucleasas de restricción y a las muestras de DNA sin cortar se les añadió el amortiguador de la muestra. Cuál es la importancia del mismo? 3. Explique porqué observa más bandas en la muestra de DNA cortado con las endonucleasas de restricción que en la muestra de DNA sin cortar. Explique su contestación. 4. El bromuro de etidio se utiliza para visualizar las bandas de DNA en los geles de agarosa. Qué otra técnica usted utilizaría para visualizar las bandas de DNA en el gel de agarosa? Explique su respuesta. 5. Si los fragmentos de DNA que usted va a separar se encuentran entre los pares de bases, Qué tipo de gel utilizaría y en qué por ciento? Explique su respuesta. 10

11 Post-prueba I. Escoja la mejor contestación: 1) La velocidad con que se mueven las moléculas sobre la matriz gelatinosa depende de: a) Los parámetros físicos de la molécula (forma, carga) b) La fricción de la molécula c) La viscosidad del medio d) La fuerza del campo eléctrico 2) Cuál de las siguientes aseveraciones es correcta? a) Las moléculas grandes se mueven rápido por lo que se observan en el fondo del gel. b) Las moléculas grandes se mueven lento por lo que se observan en el tope del gel. c) Las moléculas pequeñas se mueven rápido por lo que se observan en el fondo del gel d) Las moléculas pequeñas se mueven lento por lo que se observan en el tope del gel e) b y c son correctas 3) Los geles de agarosa: a) De por cientos bajos son relativamente rígidos y muy fácil de manipular. b) Son utilizados para separar moléculas grandes como DNA, RNA y proteínas grandes y complejas. c) Son corridos horizontalmente. d) Las moléculas se mueven del polo negativo (cátodo) al polo positivo (ánodo). 4) El bromuro de etidio se puede añadir: a) A la muestra antes de colocarla en el gel. b) Al gel cuando esta siendo preparado. c) Al amortiguador de la corrida antes de comenzar la electroforesis. d) Al gel después que termina la electroforesis. 11

12 5) La razón por la cuál debe tener precaución con el bromuro de etidio es: a) Carcinogénico b) Mutagénico c) No se debe tener precaución d) a y b son correctas e) Ninguna de las anteriores 6) Cuál de las siguientes aseveraciones es correcta? a) Existe una relación logarítmica entre el logaritmo del peso molecular de las moléculas y la distancia recorrida en el gel. b) Existe una relación lineal entre el logaritmo de la distancia de migración y el peso molecular de las moléculas. c) Existe una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular de las moléculas y la distancia recorrida en el gel. d) Todas las anteriores. e) Ninguna de las anteriores 7) Para separar bandas de DNA entre kb, se necesita preparar un gel de agarosa al 2%. Escoja la combinación correcta para preparar el gel de agarosa. a) 2 g de agarosa ml de amortiguador de la corrida b) 4 g de agarosa ml de amortiguador de la corrida c) 1 g de agarosa + 50 ml de amortiguador de la corrida d) 1.5 g de agarosa + 75 ml de amortiguador de la corrida 12

13 Soluciones A. Pre-prueba I. Pareo d 1) Geles de agarosa e 2) Loading buffer f 3) Kb g 4) Geles de acrilamida a 5) Running buffer b 6) Bromuro de etidio c 7) Marcador molecular estándar a. Facilita la conductividad de la corriente b. Luz ultravioleta c. Determinar peso molecular d. Separar moléculas de ácidos nucleicos e. Amortiguador que se le añade a la muestra f. Unidad en que se mide el peso molecular del DNA g. Separa moléculas de proteínas y ácidos nucleicos Post-prueba I. Escoja la mejor contestación: 1) La velocidad con que se mueven las moléculas sobre la matriz gelatinosa depende de: a) Los parámetros físicos de la molécula (forma, carga) b) La fricción de la molécula c) La viscosidad del medio d) La fuerza del campo eléctrico 2) Cuál de las siguientes aseveraciones es correcta? a) Las moléculas grandes se mueven rápido por lo que se observan en el fondo del gel. b) Las moléculas grandes se mueven lento por lo que se observan en el tope del gel. c) Las moléculas pequeñas se mueven rápido por lo que se observan en el fondo del gel. d) Las moléculas pequeñas se mueven lento por lo que se observan en el tope del gel. e) b y c son correctas 13

14 3) Los geles de agarosa: a) De por cientos bajos son relativamente rígidos y muy fácil de manipular. b) Son utilizados para separar moléculas grandes como DNA, RNA y proteínas grandes y complejas. c) Son corridos horizontalmente. d) Las moléculas se mueven del polo negativo (cátodo) al polo positivo (ánodo). 4) El bromuro de etidio se puede añadir: a) A la muestra antes de colocarla en el gel. b) Al gel cuando esta siendo preparado. c) Al amortiguador de la corrida antes de comenzar la electroforesis. d) Al gel después que termina la electroforesis. 5) La razón por la cuál debe tener precaución con el bromuro de etidio es porque el mismo es: a) Carcinogénico b) Mutagénico c) No se debe tener precaución d) a y b son correctas e) Ninguna de las anteriores 6) Cuál de las siguientes aseveraciones es correcta? a) Existe una relación logarítmica entre el logaritmo del peso molecular de las moléculas y la distancia recorrida en el gel. b) Existe una relación lineal entre el logaritmo de la distancia de migración y el peso molecular de las moléculas. c) Existe una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular de las moléculas y la distancia recorrida en el gel. d) Todas las anteriores. e) Ninguna de las anteriores. 7) Para separar bandas de DNA entre kb, se necesita preparar un gel de agarosa al 2%. Escoja la combinación correcta para preparar el gel de agarosa. a) 2 g de agarosa ml de amortiguador de la corrida b) 4 g de agarosa ml de amortiguador de la corrida c) 1 g de agarosa + 50 ml de amortiguador de la corrida d) 1.5 g de agarosa + 75 ml de amortiguador de la corrida Todos los derechos Liza V. Jiménez Rodríguez, Ph.D. 14