velocidades de movimiento mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de una matriz porosa

Transcripción

1 INTRODUCCIÓN En general, la electroforesis es una técnica que separa las moléculas en base a sus diferentes velocidades de movimiento mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de una matriz porosa semisólida. La matriz semisólida es un gel hecho a partir de agarosa y agua tamponada.la electroforesis en gel de agarosa es la manera más común de separar y analizar el ADN o ARN. Este gel puede ser utilizado para separar y visualizar el ADN o el ARN de varios tamaños. Este método también permite determinar si la PCR fue exitosa, si el producto resultante es del tamaño correcto, si otros productos fueron amplificados así, y si la concentración del producto resultante es adecuada para el ciclo de secuenciación. Se ha observado que los fragmentos de ADN que van desde 50 pb a pb se resuelven bien utilizando varias concentraciones de geles de agarosa. Estas características hacen de esta técnica uno de los escenarios fundamentales para los experimentos de clonación molecular. La agarosa es un polisacárido que consiste en un polímero lineal (unidades de repetición) de D-galactosa y 3,6-anhidro-L galactosa. Comercialmente, la agarosa se extrae de las algas y se purifica para su uso en electroforesis. El movimiento de las moléculas a través de un gel de agarosa depende del tamaño y la carga de las moléculas. Los ratios de moléculas que se mueven a través del gel también pueden deberse al tamaño de los poros en el gel de agarosa. La disminución de tamaño de los poros aumenta la separación de moléculas pequeñas y grandes durante la electroforesis. 1

2 MATERIALES PARA ELECTROFORESİS EN GEL DE AGAROSA a. Agarosa a. Extracto de algas marinas es una mezcla de dos componentes: el polisacárido lineal de agarosa, y una mezcla heterogénea de moléculas más pequeñas llamadas agaropectina b. 10X TBE (Tris-borato tampón de electroforesis) OR a. 108 g de base Tris [tris (hidroximetil) aminometano] + 55 g de ácido bórico 7,5 g de EDTA, sal disódica c. 10X TAE (Tris-acetato-EDTA) a. 48.4g de base Trizma + 20 ml de 0,5 M EDTA ph ,44 ml de ácido acético glacial d. Colorante gel de carga a. 50 mm EDTA + 0,2% SDS + 50% de glicerol + 0,05% w / v azul de bromofenol e. El bromuro de etidio (EtBr) (5 mg / ml) a. Tinte de ADN para intercalar entre las bases del ADN f. Equipo de electroforesis MÉTODO PARA LA ELECTROFORESİS EN GEL DE AGAROSA 1. Preparar gel al 1%, por ejemplo, añadir 0,3 g de agarosa a 30 ml TBE 1x 2

3 2. Calentar la solución hasta la ebullición en el microondas para disolver la agarosa. 3. Añadir 5 μl de bromuro de etidio para disolver la agarosa y mezclar. a. El bromuro de etidio es un agente intercalante comúnmente usado como una etiqueta fluorescente. Es comúnmente utilizado para detectar ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular. b. un mutágeno potente para asegurar que no se extendió por todo el laboratorio. 4. Prepare el sistema de electroforesis. a. Coloque la bandeja de gel en la cámara de fundición. b. Añadir el peine (s) en la ranura correspondiente (s) 3

4 5. Verter en la bandeja de gel de agarosa hasta unos 5-7mm. 6. Espere durante al menos 30 min, hasta que el gel esté frío al tacto y sea opaco en apariencia. 7. Una vez configurado, coloque el gel y la bandeja en la matriz, con los pocillos en el lado izquierdo (cátodo). 8. Llenar la matriz de gel con 0,5 X TBE suficiente para cubrir el gel entero. 9. Retire con cuidado los peines tirando de ellos hacia arriba con firmeza y suavidad en un movimiento continuo. 4

5 10. Corte un trozo de Parafilm y coloquelo horizontalmente en la mesa de trabajo. 11. Con una pipeta, colocar pequeños puntos de colorante de carga 6X (alrededor de 1-2uL) en el parafilm, en filas de 8, 1 punto por cada muestra de PCR que se cargan en el gel. 12. Con una pipeta tomar 3 μl de producto y pipetear en su correspondiente punto de tinte, y luego mezclar la muestra y el tinte pipeteando arriba y abajo. Luego, pipetear el tinte / muestra solución en un pozo propio 13. Ponga la cubierta del gel en su lugar (este paso es esencial para que el gel corra y para minimizar el riesgo de descarga eléctrica). 14. Abra el suministro de energía. Deje correr el gel durante 75 minutos a 80 voltios. 5

6 15. Compruebe si hay burbujas en el lado del cátodo para asegurar que se está ejecutando correctamente. 16. Consejos para mejorar sus geles a. No sacuda la cámara de gel durante la carga ya que esto facilitaría la perdida de las muestras por fuera de los pocillos. b. Insertar las puntas de las pipetas en los pocillos en ángulo, para evitar la perforación del pozo, lo que se traduciría en la pérdida de muestra. c. Siempre asegúrese de que el gel se ejecuta antes de marcharse. d. Trabaje tan rápido como sea posible sin sacrificar la precisión y seguridad. Cuanto más tiempo permanezcan sus muestras en el buffer, más difusas seran las bandas cuando vaya a visualizar el gel. e. Hasta que no se siente cómodo con el proceso, cargue sólo una fila de muestras a la vez, ejecute el gel durante 5 minutos, a continuación, cargue la siguiente fila de muestras. Esto reducirá al mínimo la difusión de la muestra. 17. Apague el suministro de energía. Con las manos enguantadas, retire la tapa de la caja de gel. 6

7 18. Retire el gel y la bandeja de la plataforma, evitando el goteo de la solución tampón por el banco de trabajo. 19. Póngase careta de protección UV y encienda la maquina de luz ultravioleta para ver las bandas teñidas de la muestra y la escalera del ADN. Asegúrese de que todos a su alrededor se encuentran protegidos de la exposición UV. 7