METODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA DETERMINACION DE COLIFORMES Y E. coli EN AGUA

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David Montes Araya
hace 8 años
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1 PRT Página 1 de 7 1. OBJETIVO Este método se utiliza para medir la calidad sanitaria del agua potable. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Se aplica a agua clorada o agua naturales de muy baja contaminación y sin turbidez. 3. FUNDAMENTO En la técnica de filtración por membrana, el grupo coliformes se define como todas las bacterias aeróbicas y anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas que desarrollan una colonia roja con brillo metálico dentro de 24 horas de incubación en un medio tipo Endo conteniendo lactosa. El grupo coliformes produce aldehídos por la fermentación de la lactosa. E. coli bacteria perteneciente al grupo coliformes, que en un medio adecuado y a una temperatura restrictiva de 44,5 ºC +/- 0,2ºC, fermenta la lactosa produciendo ácido, gas, posee actividad β-d-glucoronidasa y actividad triptofanasa. Son negativas a la actividad oxidasa y ureasa. La norma NCh 409, en su versión 2005, señala que: Todas las muestras que se analicen mensualmente en un servicio de agua potable, deben estar exentas de E.coli. Para la verificación de este requisito, en las muestras en las que se haya detectado la presencia de coliformes totales, se debe confirmar adicionalmente la ausencia de E. coli. 4. REFERENCIAS Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 ª Ed B Standard Total Coliform Membrane Filter Procedure.

FUNDAMENTO En la técnica de filtración por membrana, el grupo coliformes se define como todas las bacterias aeróbicas y anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas que desarrollan una

2 PRT Página 2 de 7 5. TERMINOLOGÍA Grupo Coliformes: todas las bacterias que desarrollan una colonia roja con brillo metálico dentro de 24 horas de incubación a 35 C en un medio tipo Endo conteniendo lactosa. 7 MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1. EQUIPOS Bomba de vacío 15 cm Hg y < 25 Bar de presión Baño de agua termoregulado a 44,5º ± 0,2ºC Manifol o soporte 6.2. MATERIALES Vasos de filtración plásticos de 47 mm de diámetro sin recipiente inferior (Millipore XX ) Filtros de membrana de ésteres mezclados de acetato y nitrato de celulosa, poro de 0,45 um, superficie cuadriculada, que retengan los organismos a ser cultivados, estables, libres de químicos que puedan inhibir o estimular el desarrollo microbiano, resistentes a la filtración (5 minutos), envase de 200 unidades (Millipore HAWG 047 S1) Placas Petri plásticas estériles de 47 mm. de diámetro, cj 100 unidades (Millipore PD ) Matraces de 2000 ml con Silica gel Botellón de ml MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE Agar M-Endo Les Agua de dilución buffer fosfato estéril Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST) Caldo Bilis Verde Brillante (BVB) Caldo EC-MUG

7 MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1. EQUIPOS 6.1.1. Bomba de vacío 15 cm Hg y < 25 Bar de presión 6.1.2. Baño de agua termoregulado a 44,5º ± 0,2ºC 6.1.3. Manifol o soporte 6.2. MATERIALES 6.2.1 Vasos de filtración plásticos de 47 mm de diámetro sin recipiente inferior (Millipore XX 11047.

3 PRT Página 3 de 7 7 DESARROLLO 7.1 RECUENTO COLIFORMES Colocar la membrana de 0,45 mm en el soporte con pinza estéril Homogeneizar la muestra agitándola vigorosamente 25 veces, con movimientos de arriba abajo Verter 100mL. de la muestra, en el vaso del filtro y aplicar vacío, para hacer pasar la muestra a través de la membrana. El vacío no debe exceder de 15 libras de presión Enjuagar el vaso tres veces, con porciones de 20 a 30 ml. cada vez, de agua de dilución, y aplicar vacío igual que en la muestra Cada vez que se procesen muestras incorporar un control de esterilidad de agua de dilución. Si se procesa un mayor número de muestras incorporar este control cada 10 muestras Retirar la membrana con una pinza estéril y depositarla en una placa Petri plástica, preparada previamente con 4 ml. de agar M Endo Les. Las placas preparadas se guardan en refrigeración y protegidas de la luz, y pueden usarse hasta dos semanas después de su preparación Presionar suavemente la membrana sobre el medio de cultivo utilizando pinza estéril Incubar 22 a 24 hrs. a 35+/- 0,5º C, en incubadora de aire con 15 % de humedad o en caja plástica cerrada con esponja humedecida Contar las colonias típicas y atípicas. Ocasionalmente colonias típicas pueden ser producidas por organismos no coliformes y colonias atípicas pueden ser producidas por organismos coliformes, por lo que se recomienda verificar un número representativo de colonias típicas y atípicas. Colonias típicas: color rojo, con brillo metálico. Colonias atípicas: color rojo intenso sin brillo metálico Registrar el recuento de colonias presuntivo en el registro código RG y realizar las pruebas confirmativas para coliformes.

cada vez, de agua de dilución, y aplicar vacío igual que en la muestra. 7.1.5 Cada vez que se procesen muestras incorporar un control de esterilidad de agua de dilución.

4 PRT Página 4 de TEST CONFIRMATIVO COLIFORMES Y E. COLI Inocular al menos 5 colonias típicas y 5 atípicas, en caldo LST y caldo BVB, simultáneamente Incubar los tubos de LST y BVB por 48 hrs. a 35 +/- 0,5º C y observar la formación de gas. Si los tubos de caldo BVB, resultan negativos, y los de caldo LST presentan gas, traspasar los tubos positivos nuevamente a caldo BVB, e incubar 48 hrs. a 35 +/- 0,5º C Observar la formación de gas en los tubos de fermentación de BVB, la presencia de gas y crecimiento en caldo BVB, confirma la colonia como coliformes. Anotar los resultados del test confirmativo en el registro código RG y de las cepas control en el registro código RG De los cultivos positivos en caldo LST inocular una asada a tubos con caldo EC-MUG para confirmar la presencia de E. coli Incubar los tubos de caldo EC-MUG en un baño de agua a 44,5º ± 0,2º C durante 24 +/- 2 hrs Observar bajo una fuente de luz ultravioleta, los tubos que presenten crecimiento y formación de gas, y registrar en RG y las cepas control en el registro RG Los tubos que presenten fluorescencia son considerados positivos para la presencia de E. coli. 7.3 EXPRESION Y CALCULO DE RESULTADOS Considerar aquellas placas que tienen entre coliformes y un total de todo tipo de colonias de no más de 200. El recuento de coliformes se calcula de la siguiente forma: Coliformes totales /100 ml= Nº colonias coliformes contadas x 100 ml de muestra filtrada

a 35 +/- 0,5º C. 7.2.3 Observar la formación de gas en los tubos de fermentación de BVB, la presencia de gas y crecimiento en caldo BVB, confirma la colonia como coliformes.

5 PRT Página 5 de Ajustar el recuento inicial sobre la base del porcentaje de verificación positivo como: Porcentaje de coliformes verificadas = Nº de colonias verificadas x 100 Nº total de colonias coliformes sujetas a verificación 7.4 INFORME DE RESULTADOS Los resultados del Recuento de coliformes, se expresan cuantitativamente como Nº coliformes/100 ml de muestra Si no se ha observado colonias coliformes informar como <1 coliformes/100 ml de muestra Los resultados para E. coli, se expresan cualitativamente como Presencia o Ausencia En el caso de presentarse crecimiento confluente que no permite diferenciar separación entre las colonias, expresar el resultado como Desarrollo confluente por 100 ml con o sin presencia de organismos coliformes Cuando el número de colonias tanto coliformes como no coliformes es mayor a 200 colonias por membrana o si las colonias no son distinguibles para realizar un recuento preciso, expresar el resultado como Muy Numerosas Para Contar o Confluente, respectivamente. 7.5 CONTROL DE CALIDAD Incluir como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una de cepa de Staphylococcus aureus sembrada en caldo LST y BVB utilizados para confirmación de coliformes. También incluir medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo en el momento de uso Incluir como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una cepa de Enterobacter aerogenes en Caldo EC_MUG. Tambien incluir medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo en el momento del uso.

2 Ajustar el recuento inicial sobre la base del porcentaje de verificación positivo como: Porcentaje de coliformes verificadas = Nº de colonias verificadas x 100 Nº total de colonias coliformes

6 PRT Página 6 de 7 8. REGISTROS Identificación del registro Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Registro cepas control de Carpeta roja Bajo custodia Papel 5 años y después incubadoras, RG Jefe 004 Registro cepas control de Carpeta roja Bajo custodia Papel 5 años y después baños de agua para análisis Jefe de coliformes fecales, RG Registro control de esterilidad de medios de cultivo RG Registro control de ambiente RG Registro de resultados análisis de coliformes, coliformes fecales y E. coli en muestras de agua RG Carpeta roja Bajo Carpeta roja Bajo Carpeta roja Bajo Jefe Jefe Jefe custodia Papel custodia Papel custodia Papel 5 años y después 5 años y después 5 años y después

incubadoras, RG-712.00- Jefe 004 Registro cepas control de Carpeta roja Bajo custodia Papel 5 años y después baños de agua para análisis Jefe de coliformes fecales, RG- 712.

7 PRT Página 7 de 7 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Motivo del cambio Fecha Aprobación Modificada 1 Cambio de nombre para adaptar a NCh 409/05. Agrega en item fundamento, los requisitos de la NCh. Actualizar referencia. 2 Se incluyo cado EC-MUG para adaptar a NCh 409/05 3 Especificar vigencia del medio M Endo Les plaqueado. Acotar tiempos y temperaturas de incubación. Se incluye algunas recomendaciones 4 Los puntos referidos a control de calidad se trasladaron al item 7.5 Control de Calidad. Indicación para confirmación de coliformes. Corrección formula 5 Agregar algunos cambios en la interpretación de resultados. Incluir item sobre Control de Calidad. 10. ANEXOS No Aplica

2 Se incluyo cado EC-MUG para adaptar a NCh 409/05 3 Especificar vigencia del medio M Endo Les plaqueado. Acotar tiempos y temperaturas de incubación.

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