TEMA 2.3. TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA DETECCIÓN DE LOS INDICADORES DE CALIDAD MICROBIOLÓGICA

Transcripción

1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA INGENIERIA DE MANEJO Y CONSERVACIÓN DEL MEDIO AMBIENTE PROCESOS DE CONTAMINACIÓN Y TRATAMIENTO DE AGUA TEMA 2.3. TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA DETECCIÓN DE LOS INDICADORES DE CALIDAD MICROBIOLÓGICA INSTRUCTOR: Dr. Abrahan Mora Loja, Ecuador 2015

2 Técnica de Incorporación de agar para Organismos Heterótrofos (Mesofilos, Mohos y Levaduras)

3 Incorporación de Agar

4 Rotulación de la placa de petri

5 Sacar la pipeta del contenedor y flamear suavemente, uso de propipetas

6 Medir el volumen de muestra a inocular para Organismos Heterotróficos

7 Inoculación del volumen del inóculo en la placa de petri

8 Descarte de la pipeta

9 Incorporación de agar a la muestra previamente licuado a 45 C

10 Incubar las placas de manera inversa a 35 C por 24-48h

11 Placa al cabo de 48 h de Incubación

12 Contar las colonias con el Contador de colonias Quebec y realizar los cálculos para determinar la concentración de bacterias en UFC/ml

13 Técnica de Ausencia/Presencia Para coliformes totales, fecales y E. coli

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15 Envases con el medio A/P. Registro y rotulación de muestras a procesar

16 Agitación del envase de captación con la muestra a procesar, agitar vigorosa de la muestra al menos 25 veces. Abrir el envase con la muestra y flamear la boca

17 Flamear la boca del cilindro estéril para medir el volumen del inóculo

18 Destapar el frasco del medio y flamear. Realizar la inoculación de la muestra en el medio PA

19 Flamear la boca del envase inoculado y la tapa antes de cerrarlo. Agitar la muestra inoculada para homogenizar el medio y la muestra.

20 Positivo Negativo Incubación de la muestra inoculada a 35 C por 24 a 48 h. Al culminar el periodo de incubación se reportan los resultados, los cuales son cualitativos.

21 Técnica de Membrana Filtrante para la Detección de Coliformes Totales y Fecales

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23 La técnica de filtro de membrana (MF) es altamente reproducible, puede ser utilizada para estudiar volúmenes de muestra relativamente grandes, y usualmente produce resultados numéricos más rápidamente que el procedimiento de fermentación de tubos múltiples. Esta técnica tiene limitaciones, particularmente cuando se trata de aguas con alta turbidez o con alto número de bacterias no coliformes La turbidez causada por la presencia de algas, partículas u otro material interferente, puede no permitir el ensayo de un volumen suficiente de muestra, para producir resultados significativos.

24 Medio de cultivo para coliformes totales es Agar M-Endo y coliformes fecales agar M-FC M-Endo M-FC El volumen estándar a ser filtrado para muestras de agua potable es de 100 ml. MUESTRA Para la filtración, montar el receptáculo del equipo de ensamblaje filtro- embudo, sobre un matraz con un tubo lateral de 1 litro u otro dispositivo adecuado. FILTRO- EMBUDO

25 EQUIPO DE FILTRACIÓN Conectar un matraz de aproximadamente igual capacidad entre el matraz de filtración y la fuente de vacío para atrapar el agua transportada Utilizar filtros de membrana de celulosa cuadriculadas de 0.45 micras de porosidad y 47 mm de diámetro estériles. MEMBRANA ESTERIL

26 Al comienzo de cada serie de filtraciones, utilizar unidades de filtración estériles

27 Utilizando pinzas estériles, colocar un filtro de membrana estéril (con la cuadrícula hacia arriba) sobre la placa porosa del receptáculo.

28 Colocar el filtro en su lugar y filtrar la muestra bajo vacío parcial.

29 Enjuague la superficie interior del embudo filtrando tres porciones de 20 a 30 ml de agua de dilución estéril. Para prevenir contaminación por arrastre enjuagar entre las muestras.

30 Tras el enjuagado final del proceso de filtrado y la desconexión al vacío. Quitar el filtro de membrana con las pinzas estériles, colocar el filtro de membrana en el medio seleccionado con un movimiento de rotación para evitar que quede aire atrapado.

31 E-ndo M-FC Incubar las muestras inoculadas por 24 h. El medio E-ndo a una temperatura de 35 ± 0,5 C y el medio M-FC a 45 ± 0,5 C. Al cabo del período de Incubación observar si hay crecimiento de colonias típicas rojas con brillo metálico verde para el medio E-ndo y color azul oscuro para el medio M-FC.

32 Para el recuento utilizar un Microscopio Estereoscópico binocular u otro instrumento óptico

33 Cálculo para determinar la densidad de coliformes Calcular el recuento utilizando filtros de membrana que contengan colonias de coliformes Colonias de coliformes UFC(totales)/100 ml UFC= colonias de coliformes contadas x 100 ml de muestra filtrados Si no se observan colonias coliformes reporte las colonias coliformes contadas como <0,1 coliforme / 100 ml. Es decir <0,1 UFC/100 ml

34 Técnica de Tubos Múltiples de Fermentación para la Detección de Coliformes Totales y Fecales

35 Tubos Múltiples de Fermentación para Agua Potable

36 Tubos Múltiples de Fermentación para Agua Natural o Contaminada

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39 Medios de cultivo Caldo lauril sulfato (Prueba presuntiva) Caldo lactosa bilis verde brillante (Prueba confirmativa Coliformes Totales) Medio EC (Confirmativa para coliformes Fecales)

40 Series de 5 tubos de 10 ml concentrado doble de caldo Lauril sulfato, a cada tubo se le añaden 10 ml de inóculo de la muestra.

41 Incubar la muestra inoculada por horas a 35 ± 0,5 C.

42 PRUEBA PRESUNTIVA Al cabo del período de Incubación observar si hay crecimiento (Turbiedad) y fermentación (producción de gas). Al cabo del período de incubación de (48 horas) si se observa crecimiento y producción de gas proceder a repicar en tubos con CLBVB y medio EC (Pruebas confirmativas). Si no se observa ninguna de las dos condiciones proceder a descartar la muestra inoculada. Previamente esterilizada.

43 Replicar las muestras positivas en los tubos con los medios CLBVB y medio EC, con la ayuda de un asa de siembra calibrada de 3 µl. Se recomienda realizar tres asadas

44 Incubar los tubos con el medio CLBVB a 35 C y los tubos con el medio EC Incubar a 45 C. Ambas pruebas se incuban por un periodo de 24 h

45 PRUEBA CONFIRMATIVA Si se confirma crecimiento y gas en el tubo durham en el medio CLBVB, la prueba es positiva para Coliformes Totales Si se confirma crecimiento y gas en el tubo durham en el medio EC, la prueba es positiva para Coliformes Fecales. Si no hay confirmación de crecimiento y gas en el tubo durham en el medio CLBVB, la prueba es negativa para Coliformes Totales Si no hay confirmación de crecimiento y gas en el tubo durham en medio EC, la prueba es negativa para Coliformes Fecales.

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47 Cálculo y reporte de resultados Escoger la mayor dilución con los 5 tubos positivos y las siguientes dos series de tubos. Registrar el valor de la combinación de los tres tubos como: Indice de NMP/100 ml Cuando las series de diluciones decimales sean distintas de la tabla, seleccionar los valores del NMP de la tabla por la combinación de tubos positivos y calcular de acuerdo a la siguiente fórmula: Valor del NMP (de la tabla) X 10 = NMP/ 100mL Mayor volumen estudiado en series de diluciones para determinar el NMP

48 Ejemplo Muestras Combinación Índice NMP/ ml ml ml ml de positivos 100ml a 5/5 5/5 2/5 0/ b 5/5 4/5 2/5 0/ c 0/5 1/5 0/5 0/

49 El resultado tanto para coliformes Totales como Fecales se expresa como NMP/ 100 ml Nunca el NMP de coliformes fecales pueden ser mayor al NMP de coliformes totales Cuando se utilizan porciones de 10 ml de la muestra en 5 tubos del medio se emplea la tabla para esta cantidad de tubos. Número de tubos que dan reacción positiva de un total de cinco de 10 ml cada uno Índice NMP/100 ml Límites de Confianza del 95 % (aproximados) Tubos Volores Superior Inferior 0 <2,2 0 6,0 1 2,2 0,1 12,6 2 5,1 0,5 19,2 3 9,2 1,6 29,4 4 16,0 3,3 52,9 5 16,0 8,0 Infinito

50 Ejemplo para el reporte NMP (COLIFORMES TOTALES) NMP (COLIFORMES FECALES) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) COLIFORMES TOTALES 3 TUBOS POSITIVOS? COLIFORMES FECALES 2 TUBOS POSITIVOS? 9.2 NMP/100 ml 5.1 NMP/100 ml

51 Técnica de Ultra Filtración y PCR para la Detección de Virus

52 Captación y pre filtración de muestras de virus En aguas tratadas o poco contaminadas se recomienda tomar aproximadamente 20 litros de agua, en el caso de aguas contaminadas con 100 ml es suficiente. Utilizar membranas Hidrofilica Blanca Lisa Millipore de 0.22 micras de porosidad y 47 mm de diámetro estériles. Envases Membranas Utilizar un sistema de filtración estéril. Para luego concentrar la muestra con Acido clorhídrico 0,01 N (200 ml) y 10 ml de preservante. Mantener la muestra refrigerada a 4 C hasta ser ultra filtrada en tubos falcon de 10 ml. Equipo de Filtración 10 ml de muestra

53 Ultra Filtración de muestras de virus 10 ml de muestra Colocar en tubo de micro centrifuga para concentrar la muestra Centrifugar a 4000 rpm por 20 min Para obtener una muestra de 1000 µl Calidad del ADN Extraído Visualización del ADN Extraído mediante Electroforesis Extracción de ADN por Columna de Extracción (Kit)

54 Muestras de ADN Viral Replicadas Visualización de las muestras de ADN en las Bandas para Enterovirus (230 bp) Visualización del ADN Replicado mediante Electroforesis

55 Muestras de ADN Viral Replicadas Efecto citopático inoculación de las muestras de ADN viral en cultivo de células Incubación e muestras de cultivo celular inoculadas con ADN viral muestras de cultivo celular inoculadas con ADN viral viable con la formación de bicapas

56 Técnica de Ultra Filtración y Microscopia para la Detección de Parásitos

57 Captación y filtración de muestras de Parásitos En aguas tratadas o poco contaminadas se recomienda tomar aproximadamente 20 litros de agua, en el caso de aguas contaminadas con 100 ml es suficiente. Utilizar membranas Blanca Lisa Millipore de 0.13 micras de porosidad y 47 mm de diámetro estériles. Envases Membranas Utilizar un sistema de filtración estéril. Para luego concentrar la muestra con 50 ml de preservante. Mantener la muestra refrigerada a 4 C hasta ser ultra filtrada en tubos falcon de 50 ml. Equipo de Filtración 50 ml de muestra

58 50 ml muestra de concentrado de Parásitos Centrifugar a 2500 rpm por 5 min Descartar el sobrenadante 10 ml de muestra de sedimento Le permiten aislar de manera fiable y sencilla entidades biológicas específicas de matrices complejas Muestra purificada final Separación inmunomagnética Kit combinado Cryptosporidium/Giardia

59 Muestra final purificada Detección con anticuerpos fluorescentes Preparación de laminas Detección de Giardia y Cryptosporidium microscopía de inmunofluorescencia