AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Transcripción

1 PRÁCTICA5 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Introducción En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. Objetivos - Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petri. - Obtener colonias separadas, utilizando uno o más métodos. - Estudiar la morfología de cada colonia. Material Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placas de Petri con medio de cultivo sólido y cultivo de microorganismos. Técnicas Existen distintas técnicas que pueden utilizarse: a) Extensión en superficie con cayado Serie de diluciones conocidas de la muestra Cayado Figura 5.1. Siembra por extensión en superficie para recuento. Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta Carga (1ª estría) Primera diseminación (2ª estría) Segunda diseminación (3ª estría) Última diseminación (4ª estría) Figura 5.2. Técnica de aislamiento por estría en superficie. 23

2 que esté completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de microorganismo. La posición invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas. Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado. b) Estría múltiple en superficie Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de bacterias. c) Dilución en masa En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Otra variación de esta técnica consiste en inocular Medio fundido atemperado Medio fundido Inóculo atempera calibrado Homogeneizar Figura 5.3. Siembra por dilución en masa o inclusión en agar. el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La homogeneización de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotación del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, trás homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición invertida). Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para determinar el número de microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o microaerófilos. Resultados a) Extensión en superficie: Tras el período de incubación se examinarán las placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrán diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc. Esta técnica de siembra, además de permitir que se distingan las colonias por su morfología, permite el recuento de microorganismos viables. La expresión de este recuento se hace en "unidades formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una procede de un sólo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos éstos tienden a formar agregados). A partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio. b) Por estría múltiple en superficie: Tras la incubación, se observarán las colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada. Con esta técnica se logra la separación de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien que proceden de m u e s t r a s homogéneas, pero en las que existe un elevado número. En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la morfología colonial. Figura 5.4. Aislamiento por estría en superficie. c) Dilución en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que están en la superficie tendrán distintas caracterís- 24

3 ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfología. Figura 5.5. Aislamiento por dilución en masa. Forma Borde Elevación Superficie Puntiforme Puntifor me Circular Rizoide Rizoide Irregular Irregular Entero Ondulado Ondulad o Lobulado Lobulad o Plana Plana Elevada Elevad Convexa Crateriforme Lisa Lisa o rugosa o Mate o Mate brillante o Seca o Seca cremosa o Invasiva o superficial Filamentosa Filamentos a Filamentoso Acuminada Figura 5.6. Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio sólido. 25

4 PRÁCTICA6 SIEMBRAS Objetivos - Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo: Caldo, agar inclinado y medio semisólido sembrado en profundidad. - Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo. - Comprobar la movilidad de determinados microorganismos. Material Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur o pipetas graduadas, suspensión de microorganismos y tubos con medio de cultivo líquido, sólido inclinado y semisólido. c) En medio sólido (agar inclinado): Con el asa de siembra estéril tomar los microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el área inclinada. Incubar en estufa durante horas a la temperatura más adecuada. Asa de siembra Siembra en en zig-zag zig-zag en la Técnica a) En medio líquido con asa: Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recién sembrado en estufa, durante horas a la temperatura óptima de crecimiento. Flameado Muestra Inoculación Incubación Muestra Inoculaci Incubació Flameado Figura 6.1. Inoculación de un caldo de cultivo (ver también figura III, pág. 4). b) En medio líquido con pipeta: Introducir asépticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada en el medio líquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estéril. Incubar en estufa durante horas a la temperatura más adecuada. Muestra Medio Medio (agar (agar inclinado) Figura 6.2. Siembra en un tubo de agar inclinado. d) En medio semisólido: La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar Filamento Filamento Punción Punción limpia limpia Muestra Medio (agar semisólido) Muestra Medio (agar Figura 6.3. Inoculación de un medio semisólido por picadura con hilo de siembra. 27

5 la picadura. Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de crecimiento que se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana. Incubar durante horas a la temperatura óptima de crecimiento. Resultados a y b) En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto se examinará la existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación de una película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el fondo del tubo, etc. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención de una población microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. c) En medio sólido (agar inclinado) se observará el aspecto general del medio y la aparición de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Además, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo, a A B Figura 6.4. Aspecto de cultivos en agar inclinado (A) y semisólido (B) tras la incubación. temperaturas de 4ºC. d) En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se observará que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectándose turbidez. Por eso es tan importante que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por el mismo sitio de inoculación. Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de la picadura. Este tipo de siembra en picadura sirve, también, como otro de método de conservación de microorganismos anaerobios facultativos Figura 6.5. Prueba de movilidad en agar semisólido. 1. Microorganismo móvil. 2. Microorganismo inmóvil. 3. Tubo control sin inocular. 28