ANALISIS DE COMUNIDAD: EXTRACCION Y DERIVATIZACION DE ACIDOS GRASOS TOTALES

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1 CUARTA PARTE ANALISIS DE CMUNIDAD: EXTRACCIN Y DERIVATIZACIN DE ACIDS GRASS TTALES PERFILES DE ACIDS GRASS derivados de los fosfolípidos de membranas celulares de microorganismos pueden ser utilizados para estimar biomasa microbiana (Figura 1). Además, estos perfiles proveen información sobre la estructura taxonómica, diversidad funcional y estatus nutricional de comunidades microbianas. Por ejemplo, perfiles de ácidos grasos han sido usados para distinguir entre comunidades microbianas de suelos sujetos a diferentes tratamientos agrícolas. Finalmente, extracción y análisis de ácidos grasos de organismos puros cultivados bajo condiciones estándares proveen información suficiente para el reconocimiento e identificación a nivel de especies o subespecies (Figura 2). Materiales & Equipos: Tubos de ensayo Pipetas Pasteur y de 1 ml Viales para GC Baños de agua a 80 y 100 o C Bloque térmico Cromatógrafo de gas Centrífuga

2 ACIDS GRASS TTALES 2 Reactivo g NaH 150 ml metanol 150 ml agua destilada Reactivo 2. Reactivo 3. Reactivo ml 6N HCl 275 ml alcohol metílico 200 ml hexano 200 ml metil terbutil eter 10.8 g NaH 900 ml agua destilada Figura 1: Ejemplo de ácidos grasos típicos encontrados en las membranas de microorganismos. CCCCCCCCCCCCCCCCCC H Acido Graso 18:0 CCCCCCCCCCCCCCCCCC HCH 3 18:0 metil éster CCCCCCCCCCCCCCCCCC H 18:1 cis 9 (ó trans 9) CCCCCCCCCCCCCCCCCC C H 19:0 ciclopropano CCCCCCCCCCCCCCCCCC CCC H 19:0 anteiso CCCCCCCCCCCCCCCCCC CCC H H 19:0 iso 3H H CCCCCCCCCCCCCCCC H 16:0 aldehído CH 3 CCCCCCCCCCCCCCCC CH 3 16:0 dimetil acetal

3 ACIDS GRASS TTALES 3 METDLGIA 1. Colecte asépticamente muestras de suelo de varios lugares. Tambien, podría utilizar muestras de suelo provenientes de su experimento de mineralización de hidrocarburos. Añade 2.0 g de suelo (5.0 g de suelo bajo en materia orgánica) o biomasa bacteriana (de una placa de cultivo) a un tubo con tapa revestida de teflón. 2. Añade 2.0 ml de reactivo de saponificación (Reactivo 1). 3. brevemente y saponifica a 100 o C por 30 minutos. Permite que los tubos se enfrien a temperatura ambiente. 4. Metila ácidos grasos añadiendo 4.0 ml de Reactivo brevemente e incuba a 80 o C por utos en baño de agua. Inmediatamente enfría los tubos a temperatura ambiente después de incubación. 6. Los ácidos grasos se extraen añadiendo 1.25 ml de 1:1 hexano:metilter butil eter (Reactivo 3). Mezcla invirtiendo los tubos por utos. La fase orgánica (sobrenadante) es removida con una pipeta Pasteur a un tubo limpio (13 X 100 mm). 7. Repite la extracción (paso #6) y combina fases orgánicas en el mismo tubo. 8. Lava extracto orgánico añadiendo 3.0 ml de Reactivo 4. Mezcla gentilmente por 5 minutos. Centrifuga a 4,000 rpm por 5 minutos para obtener una buena interfase. Transfiere la fase orgánica a un nuevo tubo. 9. Repite el lavado (paso #8). Transfiere la fase orgánica al vial de cromatografía. 10. Análisis de ácidos grasos metilados por cromatografía de gas. Figura 2: Perfil típico de ácidos grasos observados por cromatografía de gas 4 Staphylococcus aureus Nombre Area% 1. C14:0 IS C14: C15:0 IS C15:0 ANTEIS C16: C17:0 IS C17:0 ANTEIS C18: C19:0 ANTEIS C20: MINUTS

4 ACIDS GRASS TTALES 4 Figura 3: Representación esquemática de los pasos envueltos en la extracción y derivatización de ácidos grasos. CSECHA PRCESAMIENT DE LA MUESTRA Cultivo Fresco (Transfiere del tercer cuadrante) SAPNIFICACIN Cuatro Transferencias a Tubo de Ensayo Añade 1.0 ml Reactivo #1 METILACIN 510 seg 100 o C 5 min 510 seg 100 o C 20 min Añade 2.0 ml Reactivo #2 EXTRACCIN 510 seg 80 o C Retenga Fase de Arriba Añade 1.25 ml Reactivo #3 LAVAD Remueva Fase Inferior Transfiera a Vial de Cromatografía de Gas Añade 3.0 ml Reactivo #4 Remueve 2/3 Partes de la Fase Superior Selle

5 ACIDS GRASS TTALES 5 Datos & Análisis: Hábitat: Fecha colección de muestras: bservaciones (tipo y abundancia relativa de los ácidos grasos presentes en la muestra): PREGUNTAS Por qué es importante crecer los cultivos puros bajo condiciones estándares para propósitos de identificación? 2. Por qué se metilan los ácidos grasos antes de su análisis por cromatografía de gas?