Perfiles metabólicos por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) en plantas. Dra. Mariana G. López

Transcripción

1 Perfiles metabólicos por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) en plantas Dra. Mariana G. López mglopez@cnia.inta.gov.ar

2 PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE PERFILES METABOLICOS EN PLANTAS 1. Procesamiento de las muestras vegetales. Extracción de metabolitos de fase polar 2. Análisis de las muestras. Corrida GC-MS 3. Obtención de perfiles metabólicos 4. Análisis de los resultados

3 PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE PERFILES METABOLICOS EN PLANTAS 1. Procesamiento de las muestras vegetales. Extracción de metabolitos de fase polar 2. Análisis de las muestras. Corrida GC-MS 3. Obtención de perfiles metabólicos 4. Análisis de los resultados

4 Muestra 1. Procesamiento de las muestras vegetales. Extracción de metabolitos de fase polar Extracción * Estándar interno 2. Análisis de las muestras. Corrida GC-MS Derivatización * Estándares de RT GC-MS

5 Muestra - Condiciones controladas de muestreo: -Definir momento de muestreo, tejido a muestrear (homogeneidad) - Controles (tener en cuenta que la cuantificación es relativa) - La muestra debe congelarse INMEDIATAMENTE - Pesado de la muestra

6 Extracción - Definir el protocolo de extracción según objetivo de estudio - Se utiliza metanol frío para inhibir la actividad enzimática - Se utiliza un control interno de cuantificación (cantidad conocida de ribitol) - La muestra se seca en vacío, se modifica la atmósfera para evitar la oxidación - Puede conservarse a -80ºC durante 3 meses

7 Derivatización GC-MS - Antes de analizar la muestra se derivatiza para disminuir la polaridad de los compuesto y favorecer su volatilización Se utilizan compuestos que modifican la estructura química de los compuestos, reemplazando sus residuos - A la muestra se le agregan estándares de tiempo de retención (RTI), para corregir desviaciones de la corrida

8 Protocolo de Extracción Homogeneizar la muestra (80 mg) en mortero con N 2 líquido - polvo fino. 1,2 ml de mezcla de extracción (metanol + ribitol) fría y mantenida en hielo Vórtex 15 segundos Agitar 15 minutos a 70 C (termobloque a 1000 rpm) Centrifugar 10 minutos a rpm Transferir 600 µl del sobrenadante a un eppendorf de 2 ml limpio Agregar 300 µl de cloroformo Agregar 600 µl de H 2 0 bi-destilada calidad HPLC Vórtex 15 segundos Centrifugar 15 minutos a 4000 rpm Transferir una alícuota de 150 µl a un tubo epp de 1,5 ml Secar los extractos en speedvac 8 horas

9 Manos a la obra!!!

10 PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE PERFILES METABOLICOS EN PLANTAS 1. Procesamiento de las muestras vegetales. Extracción de metabolitos de fase polar 2. Análisis de las muestras. Corrida GC-MS 3. Obtención de perfiles metabólicos (análisis de la corrida) 4. Análisis de los resultados

11 3. Obtención de perfiles metabólicos Obtener los perfiles metabólicos, implica identificar el o los compuestos de cada uno de los picos del cromatograma y cuantificarlos - Para la identificación de los compuestos se utilizan el espectro y el Índice de Retención (IR); que representa el valor del RT corregido por los estándares de RT agregados en la muestra - Identificación manual: comparando el espectro de cada uno de los picos contra librerías de espectros. Consume mucho tiempo, requiere gran experiencia y es dificultosa en el caso de mezclas complejas - Existen programas que utilizan distintos algoritmos para extraer todos los picos en forma de matriz, identificarlos y cuantificarlos (AMDIS, ChromaTOF, TagFinder, TargetSearch, entre otros) - El programa TagFinder ha sido especialmente diseñado para la obtención de perfiles metabólicos en plantas (Max Planck Insitute)

12 3. Obtención de perfiles metabólicos

13 3. Obtención de perfiles metabólicos

14 3. Obtención de perfiles metabólicos DESARROLLO DEL TP (Guía de TP A MANO!!!) Visualización e interpretación de un cromatograma Abrir AMDIS - Abrir archivo Tomate.cdf - Familiarizarse con el cromatograma, RE, m/z, espectros - Ubicar los FAMEs (m/z: 87) - Ubicar los picos que se mencionan en la guía (para ello considerar RI, TMS y buscar en la base de datos las masas específicas de cada compuesto)

15 Visualización e interpretación de un cromatograma

16 Anotación manual de los picos Citric acid 4TMS (RTI: 9.88) Sucrose 8TMS (RTI: 14.01) Valine 2TMS (RTI: 4.52) (

17 Citric acid 4TMS (RTI: 9.88)

18 Citric acid

19 Sucrose 8TMS (RTI: 14.01)

20 Sucrose

21 Valine 2TMS (RTI: 4.52)

22 Valine

23 Anotación de los tags utilizando TagFinder La utilización de este programa implica una serie larga de pasos: 1. Se cargan los datos de todos los cromatogramas en el programa 2. El programa busca los picos de los cromatogramas y los convierte en una matriz que incluye toda la información 3. Se calculan los índices de retención de todos los picos (a partir de la información de los FAMEs) 4. Se establecen los parámetros de búsqueda de los tags y luego se buscan (la información se almacena en una matriz) 5. Se anotan los tags (identificación de los compuestos a partir de la matriz obtenida en el punto anterior). Se obtienen el perfil metabólico SEGUIR LA GUIA!!

24 Análisis de los resultados - El primer paso antes de cualquier análisis debe ser estandarizar los valores obtenidos, para que nuestras mediciones puedan ser comparables entre si. Para esto debemos conocer los datos de FW de la muestra original y la intensidad del ribitol (estándar interno) -Luego debemos realizar un análisis estadístico de los datos, puede utilizarse test de T (el más común), ANOVA, etc -Recordar que en el enfoque propuesto proporciona una cuantificación RELATIVA de los metabolitos, es decir los valores serán significativamente mayores o menores respecto a una muestra control -Finalmente, para favorecer la interpretación de set de datos tan grandes pueden utilizarse diferentes enfoques: PCA, HCA, SOM, etc.

25 Perfil Metabólico