Reporte de Validación

Transcripción

1 Fecha Responsable Reporte de Validación Introducción Pag 1(1) Leonardo Merino Introducción Nombre del método y título Aplicación del método (Eng. scope) Resumen del método Condición del método y tipo de uso Fumonisin (FB 1 and FB ) es una micotoxina producida por algunos hongos Fusarium principalmente en maiz y sus productos. Fumonisin pertenece al Grupo B of substancias (veterinary drugs and contaminants) que deben ser monitoreadas (Council Directive 96/3/EC). CEN/TS (011). Foodstuffs - Determination of fumonisin B 1 and fumonisin B in processed maize containing foods for infants and young children. HPLC method with inmunoaffinity column cleanup and fluorescence detection after precolumn derivatization Analisis de fumonisin B 1 fumonisin B en maiz y sus productos. El método es validado con harina de maiz. Fumonisin es extraído despues de calentamiento de la muestra con una mezcla de acetonitrilo, metanol y un buffer de citrato. Despues de la centrifugación y filtración de la muestra, ésta es diluída con agua desionizada y filtrada antes de pasarla a traves de columna deinmunoafinidad específica para fumonisinas. Las toxinas son separadas con HPLC, derivatizadas con OPA/mercaptoetanol y detectadas con fluorescencia. Normalizado Empírico Adaptado/modificado Frecuente/Ocasional Si No Comentario Si Si Si No No No Analito Fumonisin B 1 y fumonisin B Unidad de medida Concentración de masa, fumonisin (FB 1 ) Rango de aplicación FB 1: µg/kg Matris Harina de maíz El rango de aplicación del método será extendido posteriormente con la validación de otras matrices. Uso destinado Control oficial de fumonisin en alimentos Muestreo Se sigue las recomendaciones de la Directiva Europea (EG) nr 401/006 para métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios Trazabilidad metrológica La toma de muestras para el control oficial en la fase de comercio minorista debe usar un método que garantize que la muestra global es suficientemente representativa del lote de muestreo. La muestra global será al menos 1 kg. Almacenamiento: Temperatura ambiente Cantidades suficiente de muestra requeridas por el estudio de validación y el programa de control analítico interno serán homogenizadas y almacenadas en recipientes de vidrio herméticos. La solucion del patron certificado FB 1 (50 µg/ml) y el material de referencia fueron comercializados por Sorbent AB ( y FAPAS ( respectivamente. Las mediciones físicas fueron realizadas con los instrumentos (balanza, termómetros, etc) cuyo funcionamiento esta registrado en las especificaciones y certificados de calibración.

2 Reporte de Validación Plan de Validación Pag (1) Parámetro Rango de aplicación Marcar la caracteristica de desempeño incluída en el Comentarios estudio de validación Aplicabilidad Intervalo mínimo aplicable El método debe ser aplicable al analito, la según Codex: matriz y un nivel especificado (mínimo y/o ML 10-7 (100 µg/kg) máximo) (ML). [ML ± 3s R ] s R = Desviación estándar de la reproducibilidad (Horwitz) Precisión Veracidad Calibración & Linealidad La linealidad es estimada analizando 6 soluciones patrones y 6 soluciones de muestras fortificadas en el rango de aplicación. Sensibilidad Límite de detección (LOD) El límite de detección es calculado con la ayuda de la ecuación de la curva de calibración y su correspondiente y- intercepto (y B ) y error estándar de calibración (S y/x ). Repetibilidad Efectuar determinaciones duplicadas de las muestra fortificadas (harina de maíz) en los 7 lotes de análisis. Las desviaciones estándar dentro- lotes (s r ) del total de lotes son combinadas (pooled) segun ANOVA. Precisión intermedia Las desviaciones estándar dentro y entrelotes son sumadas como varianzas para calcular la desviación estandar total (precision intermedia) para cada nivel de concentración de las muestras fortificadas. Veracidad: grado de concordancia entre la media de una infinita serie de mediciones y un valor de referencia aceptado (C RM ). Se calcula de los análisis de: a) Material de referencia (Sesgo, B) b) Muestras fortificadas (Recuperación, R). Veracidad/Sesgo (B) Sesgo es la diferencia entre la media de un número de resultados (C o ) y un valor de referencia (C RM ). B = C o - C RM Sesgo se puede expresar como diferencia: [B = C o - C RM ], o como porcentaje: [%B = (C o - C RM /C RM ) x 100] En cada lote se efectuará analisis duplicados independientes de las muestras patrones y fortuficadas LOD = y B + 3 S y/x y B = Intercepto S y/x = error estándar de la curva de calibración Se evaluará el efecto de la matriz en el cálculo de LOD analizando muestras fortificadas. El diseño experimental propuesto estima la precision repetibilidad con 7 grados de libertad. La precision intermedia es estimada en el estudio de validación con 13 grados de libertad. Es una característica de desempeño cualitativa que incluye los errors sistemáticos y es cuantificada como sesgo y/o recuperación. Análisis duplicado del material de referencia (FAPAS) realizados en cada uno de los 7 lotes independientes de análisis. La relación entre recuperación (R), y sesgo (B) es la siguiente: %R = %B

3 Robustez Incertidumbre (U, k=) Veracidad/Recuperación (R) Diferencia entre los resultados de la muestra fortificada y la muestra original, dividida por la concentración añadida. Selectividad Los cromatogramas de las muestras fortificadas son comparadas con los cromatogramas de las soluciones estándares certificadas (FB 1 ), para chequear la forma de los picos cromatográficos y sus tiempos de retención. El ensayo de robustez (cambios menores al procedimiento del método) no es requerido por la Directiva Europea 00/657/EC Los resultados de la validación son usados para estimar la incertidumbre de la precisión intermedia (u Rw ) y la incertidumbre del sesgo (u R /R). Ambas incertidumbres son sumadas para estimar la incertidumbre combinada. u c = u + Rw ( ur / R) Efectuar análisis duplicado de las muestras originales y muestras fortificadas (harina de maíz) en los 7 lotes a concentraciones de ( ) µg/kg. Esta comparación ayuda a identificar eventuales interferencias. El método siendo un método normalizado ha sido validado en un estudio colaborativo con la participación de 10 laboratorios. La incertidumbre expandida (U) para un nivel de confidencia de 95% es igual a: U = u c Control de Calidad Interno Control de Calidad externo Los resultados del estudio de validación servirán de base para construír cartas de control. Estas cartas serán actualizadas con los resultados de las muestras de control analizadas en cada lote del programa de control. El laboratorio participará en Ensayos de Aptitud adecuados, considerando el tipo de muestra, concentración del analito y periodicidad.

4 Reporte de Validación Parámetro Parámetro de desempeño Pag 4(1) Descripción Es el intervalo de aplicación del método en que la incertidumbre calculada es aceptable. Rango de aplicación y Límite de detección (LOD) Requerimientos Criterios recomendados para el rango mínimo aplicable (Codex) Para ML 10-7 (100 µg/kg), el rango mínimo aplicable debe ser [ML ± 3s R ] Para ML < 10-7 (100 µg/kg), el rango mínimo aplicable debe ser [ML ± s R ] Valor númerico de límite de detección según recomendación del Codex. Cuando el ML 100 µg/kg, el LOD ML x (1/10) LOD ML x (1/10) = 1000 µg FB 1 /kg x 1/10 = 100 µg FB 1 /kg Experimentos Cálculo del rango mínimo de aplicación. Calcular la ecuación de regresión de s Rw vs la concentración de las 5 niveles de muestras fortificadas. (Fig. 1). Cálculo del LOD del instrumento (soluciones patrón) La curva de calibración es calculada del análisis de 6 soluciones patrones dentro del rango de aplicación siguiente (Fig. ): 40, 80, 160, 400, 960 och 1600 ng/ml. Cálculo del LOD del método (muestras fortificadas) La curva de calibración es calculada del análisis de 6 muestra-blanco de harina de maíz fortificadas con las siguientes concentraciones (Fig. 3): Fumonisin B 1 : 0, 00, 400, 600 y 800 µg/kg. Evaluación De la ecuación de regresión de s Rw vs la concentración de las muestras fortificadas se calcula el s Rw a la concentración del ML. Se aplica la recomendación del Codex. Esta misma ecuación nos permite calcular la precisión intermedia (promedio) dentro del rango de aplicación (pendiente de la curva de regresión). Los valores calculados del intercepto y el error estandar de las curvas de calibración de las soluciones patrones y fortificadas fueron usadas para el cálculo de los LOD del instrumento y del método. Resultados Rango mínimo aplicable De la ecuación de la Fig. 1 se calcula s Rw a la concentración del ML (1000 µgfb 1 /kg) y = 0.113x = (1000) = 15 µgfb 1 /kg Rango minimo aplicable según Codex: ML 10-7 =100 µg/kg, [ML ± 3s R ] = 1000 ± 3 (15) = 1000 ± 375 = Fig 1. Precisión bajo condiciones de reproducibilidad

5 La figura muestra también que para FB 1 el método tiene una precisión intermedia (promedio) de RSD Rw =11.3%. Límite de detección del instrumento (LOD) Las gráficas muestras los resultados de los 7 lotes (7 x = 14 análisis) realizados durante el estudio de validación. El LOD (instrumento) = µg/kg. Fig. Curvas de calibración con soluciones patrón Límite de detección del método (LOD) LOD = y B + 3S y/x LOD = (.53) = = µgfb 1 /kg LOD (harina de maíz) = 10 µgfb 1 /kg Fig 3. Curvas de calibración con muestras fortificadas Conclusiones Los valores numéricos de los límites de detección del instrumento ( µg/kg) y del método (10 µg/kg, matriz: harina de maíz) estan muy por debajo del valor de 100 µg/kg calculado aplicando la recomendación de Codex. La precisión intermedia promedio dentro del rango de aplicación del método (11%), es mucho menor a los valores de precisión de 60% y 30% para concentraciones menores de 500 µg/kg y mayores de 500 µg/kg, respectivamente; establecidos en la Directiva Europea 401/006. El método fue evaluado a concentraciones de fumonisin FB 1 aun muy por debajo del rango mínimo calculado siguiendo la recomendación de codex (65 µgfb 1 /kg), obteniendose resultados satisfactorios de LOD y precisión intermedia, s Rw.

6 Parámetro Reporte de Validación Parámetro de desempeño Pag 6(1) Descripción Repetibilidad: variación de repetidas mediciones de la misma muestra de ensayo hechas por el mismo analista, el mismo día, usando el mismo instrumento. Precisión intermedia: variación de repetidas mediciones de la misma muestra de ensayo en diferentes días, usando el mismo instrumento. Requerimientos Precisión: repetibilidad y precisión intermedia Requerimientos para fumonisin-regulation (EC) No. 401/006 Nivel (μg/kg) RSD r (%) RSD R (%) > Experimentos El diseño experimental se basa en el Analisis de Varianzas (ANOVA) de un factor. Se efectúan n determinaciones de un grupo representativo de muestras en cada uno de los p lotes de análisis. Se recomienda que el producto p x n no debe ser menor que 10, de preferencia 0. Las muestra de ensayo fueron analizadas por duplicado (n=) en 7 lotes independientes (p=7), a lo largo de un periodo de 7 semanas. Tabla 1. Muestras de ensayo analizadas en el estudio de validación Código Muestra de ensayo Concentratión No análisis/ lote 0 6 soluciones patrón FB 1 = (0-1600) ng/ml 1 1- Muestra original [C o ] Conc. original [C o ] 3-4 Muestra fortificada 1 [C o ] + [00 µl patrón] 5-6 Muestra fortificada [C o ] + [400 µl patrón] 7-8 Muestra fortificada 3 [C o ] + [600 µl t patrón] 9-10 Muestra fortificada 4 [C o ] + [800 µl patrón] RM (harina de maíz) FB 1 =501 µg/kg Precisión de fumonisin FB 1 En la Tabla se muestran los resultados de análisis de la muestra fortificada 3. Tabla. Concentración de FB 1 en ug/kg de la muestra fortificada 3 Muestra Lote (µg/kg) fortificada I II III IV V VI VII Ensayo Ensayo Evaluación El ANOVA de un factor fue utilizado para el cálculo de s r och s Rw.

7 La RSD r ( %) para cada nivel de concentración es calculada de los análisis duplicados de los 7 lotes. La precisión intermedia expresada como RSD Rw (%) para cada nivel de concentración es calculada del análisis del total de 14 muestras de ensayo. Resultados En la Tabla 3 se resumen los resultados de los valores de precisión de repetibilidad y reproducibilidad intermedia de todas las muestras de ensayo analizadas en el estudio de validación. Tabla 3. Resultados de la media y precisiones Muestra de ensayo Media RSD r (%) RSD Rw (%) Muestra original [C o = 66 µg/kg] Muestra fortificada 1 [C o + 00 µg/kg] Muestra fortificada [C o µg/kg] Muestra fortificada 3 [C o µg/kg] Muestra fortificada 4 [C o µg/kg] Muestra fortificada 5 [C o µg/kg] Material de Referencia (harina de maíz) Conclusiones Las precisiones de repetibilidad (% RSD r ) y precisión intermedia (% RSD RW ) calculados en el estudio de validación (Tabla 3) son menores a los exigidos en la Directiva Europea 401/006. El método cumple los requerimientos para repetibilidad y reproducibilidad para los 7 niveles de concentración de fumonisin FB 1 estudiados.

8 Parámetro Veracidad: Sesgo y Recuperación Reporte de Validación Parámetro de desempeño Pag 8(1) Descripción Sesgo: Diferencia entre la media de un número grande de resultados (C o ) y un valor de referencia aceptado (C MR ). (Procedimiento: Usando materiales de referencia). Recuperación: representa la cantidad de analito añadido y que es recuperado en el análisis. (Procedimiento: Usando muestras fortificadas). Requerimientos Requerimientos para Fumonisin-Regulation (EC) No. 401/006 Nivel μg/kg Recuperación (%) to 10 > to 110 Experimentos Veracidad/Sesgo Análisis duplicado del Material de Referencia (Fapas: harina de maíz) son realizados en los 7 lotes. Veracidad/Recuperación Análisis duplicado de la muestra original y la muestra fortificada son realizadas en los 7 lotes. Preparación y añadido de solución de fortificación a. Preparación de solución de fortificación (0 µg /ml FB 1 ): Mezclar ml de la solución patrón certificada de FB 1 (50 µg/ml); y.5 ml de acetonitrilo (50%) en un frasco (5 ml). b. Volúmen a añadir: La Tabla indica los volumenes que serán añadidos a 0 gramos de muestra original en cada lote de análisis. Tabla 4. Muestras y volúmenes de solución de fortificación añadidos Muestra Volúmen de fortificación (µl) Muestra original [C o = 66 µg/kg] - Muestra fortificada 1 [C o + 00 µg/kg] 00 µl = 4 µg Muestra fortificada [C o µg/kg] 400 µl = 8 µg Muestra fortificada 3 [C o µg/kg] 600 µl = 1 µg Muestra fortificada 4 [C o µg/kg] 800 µl = 16 µg Muestra fortificada 5 [C o µg/kg] -MR 1000 µl = 0 µg Material de referencia (Fapas) - Dejar hasta el dia siguiente las muestras fortificadas para garantizar la evaporación del solvente y las condiciones de equilibrio. Nota: Material de referencia interno (Muestra fortificada 5- MR). Una cantidad mayor de la muestra original (00 g) fue fortificada y homogenizada al inicio del estudio de validación. Evaluación Sesgo (B) se calcula como la diferencia del valor medio (C o ) y el valor de referencia (C RM ): B = C o - C RM

9 Recuperación (%R) se calcula de la ecuación: Csp Cb % R = 100 Cs Donde: C sp es la concentración media, despues de la fortificación C b es la concentración media de la muestra original, antes de la fortificación C s es la concentración fortificada Test de significancia. Para determiner el uso de factor de corrección se responde a la pregunta: Es[R-1] mayor que u R, la incertidumbre en la determinación de R? Si el t obs > t crit R es significativamente diferente y se usa como factor de corrección. R 1 t obs = > u r t crit Resultados Tabla 5. Factores de recuperación (%) y su significación estadística Muestra de ensayo Valor medio (%) Significancia estadística Muestra original [C o = 66 µg/kg] - - Muestra fortificada 1 [C o + 00 µg/kg] 81 Si Muestra fortificada [C o µg/kg] 86 Si Muestra fortificada 3 [C o µg/kg] 84 Si Muestra fortificada 4 [C o µg/kg] 81 Si Muestra fortificada 5 [C o µg/kg] -MR 71* Si Material de referencia (Fapas) 76 Si El test de significancia fue aplicado para justificar el uso de un factor de corrección por recuperación. Los experimentos muestran que hay un efecto sistemático significativo (95% nivel de confianza), por lo tanto una corrección por recuperación debe ser usado para corregir los resultados. Nota: La muestra fortificada 5 (material de referencia interno) dio un valor medio de recuperación significativamente menor (71%). Este resultado indicaría que el mayor tiempo de contacto entre el analito y la matriz influye en la posterior eficiencia de la extracción. Conclusiones Los requerimientos de recuperación establecidos en la Directiva Europea 401/006 son cumplidos para todos los niveles del rango de aplicación evaluados.

10 Reporte de Validación Parámetro de desempeño Pag 11(1) Parámetro Incertidumbre combinada y expandida Descripción Incertidumbre: es una medida cuantitativa de la calidad de una medición y considera los efectos de los errores aleatorios y sistemáticos Requerimientos Los requerimientos de precisión y recuperación establecidos por la Directiva Europea 401/006 son convertidos a unidades de incertidumbre. Para > 500 µg/kg: Precisión 30% (expresado como intervalo de confianza) Recuperación: % (expresado como rango) Estos valores equivalen a los siguientes unidades de incertidumbre: u precisión = 30/= 15 (dividir el intervalo por ) u sesgo = 0/ 3 = 11.6 (dividir la mitad del rango por 3, distribución triangular) Estas dos fuentes de incertidumbre son combinadas según la ecuación: uc = + u precisión u ( ) ( sesgo ) uc = (15) + (11.6) = 19% La incertidumbre expandida (95%) es: U (k=) = x u c = x (19) = 38% Para 500 µg/kg: U (k=) = x u c = x (35) = 70% Experimentos Los resultados del análisis duplicado en los 7 lotes fueron utilizados para el cálculo de la precisión intermedia y la precisión del cálculo de recuperación. Los resultados de incertidumbre para el total de muestras analizadas son resumidos en la Tabla 6. Evaluación Las dos fuentes de incertidumbre calculadas fueron combinadas según la ecuación: u c = u + Rw ( ur / R) Resultados Conclusiones Tabla 6. Resultados de las incertidumbre relativas Muestra 00 Muestra de ensayo original µg/kg 400 µg/kg 600 µg/kg 800 µg/kg 1000 µg/kg Concentración, µg FB 1 /kg Incertidumbre de precisión, u Rw , Incertidumbre de recuperación, u R /R Incertidumbre combinada, u c Incertidumbre expandida, U Los valores de incertidumbre de la muestra original y muestras fortificadas cumplen los requerimientos de incertidumbre estimados de los requerimientos de precisión y sesgo dadas en la Directiva Europea 401/006.

11 Reporte de Validación Resultados y conclusiones Pag 11(1) Resúmen del estudio realizado El método normalizado CEN/TS (011) (Metod SLV K-m50-f5) para la determinación de Fumonisin FB 1 en harina de maíz ha sido validado. Las características de desempeño raango de aplicación, límite de detección, repetibilidad, precisión intermedia, veracidad (sesgo y recuperación) e incertidumbre combinada han sido evaluados. Resultados Planificación del control de calidad interno Control de Calidad externo Conclusión acerca de la aplicabilidad del método Los requerimiento analíticos establecido en la Directiva Europea (EC) No. 401/006 (y criterios recomendados por Codex) para rango de aplicación, límite de detección, repetibilidad, reproducibilidad y recuperación son cumplidos. Los resultados de recuperación de los 7 lotes de muestras analizadas en el estudio de validación (14 resultados de la Muestra fortificada 1[C o + 00 µg/kg] son utilizados como base para construír cartas de control. En cada nuevo lote de análisis del programa de control oficial se deberá incluír el análisis de por lo menos una muestra fortificada (+00 µg/kg = 4 µg FB 1 ). [Ver Apéndice - Pag 1(1)] El valor medio de recuperación de las muestras de la carta de control actualizada será usado para corregir los resultados de las muestras analizadas. El laboratorio participó en un Ensayo de Aptitud organizado en el periodo final del estudio de validación. FAPAS Proficiency test 87: Fumonisin in Maiz Flour Fecha: Mayo junio 01 Analito: Fumonisin FB 1 Valor reportado = 486 µg FB 1 /kg Valor assignado = 591 µg FB 1 /kg z-score = Método cumple los requerimientos para su uso en el programa de control oficial de fumonisin Una corrección por recuperación deberá ser usado al reportar los resultados analíticos Fecha Responsable del Estudio de Responsable de Control de Validación Calidad Leonardo Merino Maria Haglund

12 Carta de control Fumonisin-FB1 Nueva carta Datos estadísticos CEN/TS SLV k-m50-f5/kolonn: Zorbax 5B-C18 Media 81 Dionex (Cromeleon Ver 7.1) Desviación estándar 16,74 x Desviación estándar 33,5 Resultado 3 x Desviación estándar 50, No. Fecha <unidades> Firma Comentario! Maíz (Validación)! Maíz (Validación)! Maíz (Validación)! Límites Maíz (Validación)! Maíz (Validación)! Usar los límites de: (Enter) Maíz (Validación)! Maíz (Validación)! Límites de otro origen Maíz (Validación)! Media (m) Maíz (Validación)! Desviación estándar (s) Maíz (Validación)! x Desviación estándar Maíz (Validación)! 3 x Desviación estándar Maíz (Validación)! Maíz (Validación)! Límite de alerta Dev. estándar Maíz (Validación)! Límite de acción 3 Dev. estándar Muestra (M5545)! Muestra(M5545)! Límite de alerta inferior 60 (m-s) Muestra (M5645)! Límite de alerta superior 10 (m+s) Muestra (M5709)! 19 Límite de acción inferior (m-3s) 0 Límite de acción superior (x+3s)! = Fuera del Límite de acción, * = Fuera del Límite de alerta FB 1 - Muestra fortificada (00 µg/kg = 4 µg) 10 % 60% 0, Límite de acción Límite de alerta Media (m) Resultado Comentarios: Muestra fortificada: 0 gramos de la muestra es fortificada con 00 µl de la solución de fortificación(0 µg/ml FB 1 ). Este volumen contiene 4 µg FB 1. Performance criteria (Regulation (EC) No. 401/006): Para niveles de concentración de FB µg/kg tel rango de recuperación satisfactorio debe estar entre (60-10 %)