PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PESTICIDAS ORGANOCLORADOS (OCP) EN MUESTRAS DE LECHE MATERNA
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- Agustín Ríos Maidana
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1 Hoja 1 de 6 PROCEDIMIENTO PURIFICACIÓN DE PESTICIDAS (OCP) EN MUESTRAS DE 1. Introducción 2. Objetivo 3. Alcance 4. Realización 4.1. Extracción 4.2. Purificación 4.3. Paso a vial 4.3. Adición del patrón interno o de jeringa 5. Anexos 5.1. Acondicionamiento del Florisil 5.2 Preparación de las columnas del Florisil 5. Histórico de modificaciones Enero 2011 Elaborado por: Revisado por: Aprobado por: Fdo.: M.G. Martrat LABORATORIO DE DIOXINAS IDÆA-CSIC Fecha: 27/01/2011 Fdo.- E. Abad LABORATORIO DE DIOXINAS IDÆA-CSIC Fecha: 4/02/2011 Fdo.- H. Fiedler UNEP Chemicals Branch Fecha: 8/02/2011
2 Hoja 2 de 6 1. INTRODUCCIÓN Este procedimiento ha sido elaborado en el Laboratorio de Dioxinas del Departamento de Química Ambiental del Instituto de Diagnóstico Ambiental y Estudios del Agua (IDÆA) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) de Barcelona (España), en el Marco de Colaboración con el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA) para dar apoyo a la Implantación del Plan de Vigilancia Mundial de Contaminantes Orgánicos Persistentes (COP) 1 bajo el Convenio de Estocolmo. El programa incluye a los países participantes en Latinoamérica y el Caribe en los proyectos de capacitación de los laboratorios financiados por el Fondo para el Medio Ambiente Mundial (FMAM) 2, así como del Enfoque Estratégico para la Gestión de Productos Químicos a Nivel Internacional (SAICM) 3. Las personas participantes en la elaboración de este documento: 2. OBJETIVO Dr. Esteban Abad Holgado Dra. Heidelore Fiedler Prof. Josep Rivera Aranda Dra. Manuela Ábalos Navarro Sra. Laura Morales Pérez Sr. Jordi Sauló Dalmau Sra. Mª Generosa Martrat Castellví Sr. Jordi Parera Costa Sr. Miquel Àngel Adrados León Sr. Karell Martínez Guijarro Sr. Joan Rivera Austrui El objetivo del Plan de Vigilancia Mundial (PVM) es apoyar la evaluación de la eficacia del Convenio de Estocolmo en relación a las concentraciones ambientales de fondo mediante medios que tienen un gran potencial de comparabilidad. La Conferencia de las Partes ha decidido que sea la vigilancia del aire y la exposición en leche materna o sangre humana, los medios prioritarios para la primera evaluación. El objetivo del presente procedimiento es describir la sistemática seguida para la extracción, y purificación del análisis de pesticidas organoclorados (OCP) en muestras de leche materna En inglés: Global Monitoring Plan for Persistent Organic Pollutants (GMP) En inglés: Global Environment Facility (GEF) En inglés: Strategic Approach to International Chemicals Management (SAICM)
3 Hoja 3 de 6 3. ALCANCE Este procedimiento describe la sistemática seguida para la extracción y purificación del análisis de OCP en muestras de leche materna. 4. REALIZACIÓN 4.1. EXTRACCIÓN Pesar, a temperatura ambiente, 20 g de muestra en una probeta 100 ml, con una precisión de 0,1 g. A continuación diluir la muestra con agua ultra pura hasta un volumen de 100 ml usando la probeta con la que se ha pesado la muestra. Colocar la muestra diluida de la probeta de 100 ml en un embudo de decantación de 1 L Añadir 1 g de oxalato sódico, medidos con una precisión de 0,1 g, tapar el embudo, girarlo, abrir la llave para permitir la salida de gases y agitar manualmente durante 20 segundos. Cerrar la llave de nuevo y girar el embudo Añadir 100 ml de MeOH, medidos con probeta, tapar el embudo, girarlo, abrir la llave para permitir la salida de gases y agitar manualmente durante 10 segundos. Cerrar la llave de nuevo y girar el embudo Fortificación (Sólo para método de la dilución isotópica): Por pesada: Sacar el vial con el patrón marcado de la nevera y esperar a que alcance la temperatura ambiente Tomar un vial de 1 ml. Tararlo en una balanza analítica, y con la ayuda de una micropipeta o jeringa de vidrio medir el volumen de patrón necesario para realizar la fortificación. Pesar el vial con el patrón adicionado en una balanza analítica Medir aproximadamente 10 ml de éter dietílico. Con una pipeta Pasteur, trasvasar el patrón contenido en el vial sobre la muestra. Con una pipeta Pasteur, trasvasar parte de los 10 ml de disolvente al vial que contenía el patrón. Con una pipeta Pasteur, vaciar el vial sobre la muestra. Repetir los pasos anteriores hasta que no quede disolvente Por volumen: Con la ayuda de una micropipeta o una jeringa de vidrio medir el volumen de patrón necesario para realizar la fortificación. Añadir el patrón a la muestra Medir 100 ml más de éter dietílico con probeta, añadirlos al embudo de decantación. Tapar el embudo, girarlo, abrir la llave para permitir la salida de gases y agitar manualmente durante 30 segundos. Cerrar la llave de nuevo y girar el embudo.
4 Hoja 4 de Añadir 100 ml de éter de petróleo, medidos con probeta, tapar el embudo, girarlo, abrir la llave para permitir la salida de gases y agitar manualmente durante 1 minuto. Cerrar la llave de nuevo y girar el embudo. Dejar separar las fases acuosa y orgánica por gravedad. Recoger la fase acuosa (fase inferior) en una probeta de 250 ml Recoger la fase orgánica en un matraz de 1 L. Concentrar el extracto contenido en el matraz, hasta aproximadamente la mitad de su volumen Colocar de nuevo la fase acuosa en el embudo de decantación Repetir los apartados 4.1.5, 4.1.6, y Recoger la fase orgánica en el mismo matraz de la primera extracción Concentrar el extracto contenido en el matraz, hasta aproximadamente 5-10 ml. Trasvasar el extracto a un balón de 250 ml previamente etiquetado con la referencia de la muestra, intentando no coger restos de oxalato durante el proceso de trasvase Añadir 2-3 veces aproximadamente 2 ml de éter de petróleo al matraz original para limpiarlo, intentar no coger restos de oxalato. Añadir el disolvente de lavado al balón de 250 ml Concentrar el extracto contenido en el matraz, hasta aproximadamente 1-2 ml o hasta observar la presencia de un residuo graso Adicionar 100 ml de hexano medidos con probeta, y concentrar los extractos hasta un volumen final de 1-2 ml PURIFICACIÓN Una vez preparada la columna de Florisil según el punto 5.1, colocar bajo la columna un matraz esférico de 250 ml previamente identificado con la referencia de la muestra y fracción primera. Asegurarse que la llave de la columna esté cerrada Medir 200 ml de éter de petróleo: dietil éter al 6% con la ayuda de una probeta, disolver el residuo de muestra contenido en el matraz. En el menor volumen posible de éter de petróleo: dietil éter al 6% de la probeta y con la ayuda de una pipeta Pasteur transvasar la muestra a la cabecera de la columna. Lavar el matraz que contiene la muestra con unos mililitros de éter de petróleo: dietil éter al 6% o (de los de la probeta de 200 ml) y transvasarlos a la cabecera de la columna. Lavar el matraz seis veces como mínimo. El volumen final será de 200 ml Abrir la llave para que comience la elución de la columna En el momento en que el hexano llega a la cabecera de la columna de sulfato de sodio se cierra la llave.
5 Hoja 5 de Se retirará el matraz de 250 ml y se colocará otro de 250mL etiquetado con el nombre de la muestra y fracción segunda adicionar 200 ml de una disolución éter de petróleo: dietil éter al 15% a la columna de Florisil. Abrir la llave para que comience la elución. En el momento en que el hexano llega a la cabecera de la columna de sulfato de sodio se cierra la llave Se retirará el matraz de 250 ml y se colocará otro de 250mL etiquetado con el nombre de la muestra y fracción tercera. Adicionar 200 ml de una disolución éter de petróleo: dietil éter al 50% a la columna de Florisil. Abrir la llave para que comience la elución. La columna de Florisil se considera finalizada cuando todo el disolvente haya eluido a través de la columna Concentrar los extractos, procurando que la temperatura del baño no supere los 30ºC 4.3. PASO A VIAL Con una pipeta Pasteur, trasvasar el extracto contenido en el matraz procedente de la columna de Florisil en un vial de 2 ml. Concentrar el extracto del vial bajo una corriente de nitrógeno. Cuando el volumen contenido en el vial es de unos 20 µl se realizan los lavados del matraz que contenía la muestra. Con una pipeta Pasteur, trasvasar 2 ml de hexano al matraz que contenía la muestra. Con una pipeta Pasteur, trasvasar el contenido del matraz al vial. Repetir los pasos anteriores 4 veces más. Finalmente, dejar el vial bajo la corriente de nitrógeno hasta que llega a sequedad ADICIÓN DEL PATRÓN INTERNO O DE JERINGA Por pesada: Sacar el vial con el patrón marcado de la nevera y esperar a que alcance la temperatura ambiente Coger el vial que contiene la muestra. Tararlo en una balanza analítica, y con la ayuda de una micropipeta medir el volumen de patrón interno o de jeringa necesario y adicionarlo al vial de muestra. Pesar el vial con el patrón adicionado en una balanza analítica Por volumen: Con la ayuda de una micropipeta o una jeringa de vidrio medir el volumen de patrón interno o de jeringa necesario y adicionarlo al vial de muestra.
6 Hoja 6 de 6 5. ANEXOS 5.1. ACONDICIONAMIENTO DEL FLORISIL Pesar la cantidad de Florisil correspondiente al número de muestras a las que se les va a realizar la purificación en una cápsula de porcelana Colocar la cápsula en el horno mufla En el indicador del horno mufla marcar la temperatura de activación del Florisil (675ºC) Ponerla en marcha y dejar el Florisil en activación como mínimo 16h Una vez transcurridas el tiempo mínimo de activación, parar la mufla y dejar enfriar El Florisil se ha de utilizar dentro del día siguiente a su activación o se ha de volver a activar PREPARACIÓN DE LA COLUMNA DE FLORISIL Coger una columna de vidrio de 1.5 cm. de diámetro y 60 cm. de longitud y colocar una base de lana de vidrio Pesar y añadir dentro de la columna 20 g de Florisil, activado tal y como se describe en el apartado 5.1 del presente procedimiento Pesar y añadir dentro de la columna 2 g de sulfato sódico Después de cada adición golpear ligeramente la columna para evitar la formación de caminos preferenciales Acoplar el matraz de adición Eluir la columna con 50 ml de hexano Antes de que se seque cerrar la llave 6. HISTÓRICO DE MODIFICACIONES. FECHA DE MODIFICACIÓN REFERENCIA DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS REVISIÓN Nª 24/07/2012 Primera Edición 1
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