Métodos de Esterilización

Transcripción

1 CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES Métodos de Esterilización Dra. Leticia Bucio Ortiz

2 Esterilización Métodos: Físicos. Mecánicos. Químicos.

3 Físicos. Calor Fuego Directo Calor Seco Estufas Calor Húmedo Tindalización Ebullición 1884 Charles Chamberland

4 Mecánicos. Filtración: a) Filtros profundos o Filtros de profundidad. b) Membranas Filtrantes c) Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo)

5 Tanque de Gas Nitrógeno Tanque depósito del líquido a esterilizar Membranas para esterilizar Solución Estéril

6 Químicos Agentes Químicos Iodopovidona (pervinox) Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o cloruro de Zefirano). Hipoclorito de sodio Estufa de esterilización por Óxido de Etileno Aldehídos Glutaraldehído Antisépticos Desinfectantes y/o esterilizantes Alcoholes Iodo Agentes catiónicos, aniónicos, anfóteros Organomercuriales Colorantes Cloro y com. clorados Aldehídos Óxido de etileno Comp. Fenólicos Ácidos y álcalis

7 Radiación Ionizantes Rayos UV Rayos gamma

8 Radiación Ionizantes Rayos UV Rayos gamma

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10 REACTIVOS EMPLEADOS EN EL CULTIVO CELULAR

11 Composición General del Medio de Cultivo. Sales: CaCl 2, NaHPO 3, MnSO 4, SnCl 2, etc). Aminoácidos: Ala, Val, leu, aasp, Gly Vitaminas (Biotina, ác. Fólico, pantotenato de sodio, riboflavina. Otros Componentes (glucosa, ác. Linoléico, rojo de fenol, timidina). 1. Suero o substitutos del suero. 2. L-Glutamina. 3. Antibióticos. 4. Factores de crecimiento adicionales. * hormonas, anticuerpos, el medio no debe estar suplementado.

12 Medio conteniendo Suero. Es el suplementó más frecuente. Razones: Algunas células sólo proliferan al adicionarle suero. Provee biodisponibilidad de hormonas. Incrementa la capacidad buffer del medio. el medio extracelular óptimo a las células. El suero es una mezcla compleja y heterógenea de proteínas, hormonas, factores de crecimiento, iones y otros componentes no definidos. Medio no definido, suero varía de lote a lote. Medios definidos, sin suero pero con apropiados suplementos. Diferentes animales. Rebaños. Razas. Países.

13 1. Suero de ternera. 2. Suero de ternera donante (ternera hasta de 8 meses). 3. Suero de ternera fetal (terneras fetales, por cardiopuntura). 4. Suero de caballo (edad desconocida). 6. Suero de cordero (< 6 meses). 5. Suero de mono (mono verde). 7. Suero de pollo (sacrificados). 8. Suero Humano (adultos). 9. Suero de porcino

14 Suero inactivado, incubado a 56º C, 30. Suero correcto? Tipo celular Experimento

15 Medio de Cultivo libre de Suero, claramente definido. Al elegir (contenidos individuales del suero), frec. cant. fluctúan en cal, y Esto es importante cuando los experimentos son de tiempo prolongado. Sueros: Riesgo de contaminación microbial. Algunos medios con suero deben esterilizarse. Economía. El cambio a medio libre de suero, no debe ser abrupto. Medio Definido: se conoce la concentración de todos los componentes.

16 Cultivo Celular en el laboratorio. 1) Accesorios necesarios, instrumentos, etc. 2) Esterilidad en campana de flujo laminar. 3) Proveer a las células para un periodo de cultivo. 4) Preparado para experimentos en cultivo celular. Alrededores adecuados: Cuarto de cultivo. Campana de flujo laminar e incubadora. Preparación de medios de cultivo cuidadosa y críticamente. Considerar: oriesgo de movimiento. osin tráfico de personal. odistancias cortas entre unidades individuales. osuficiente espacio para moverse.

17 Seguridad en el Cultivo Celular. Reglas de seguridad y precaución (DNA, material patógeno, substancias radiactivas, carcinógenos, corrosivos, etc.) Prohibido: fumar, beber y comer. Ropa adecuada para protección, (bata algodón, gorros y guantes). Prohibido pipetear con la boca, utilizar pipeteadores o perillas estériles. Posibles peligros deben ser dados a conocer a los compañeros. Lavar manos entre descanso y descanso. Limpieza escrupulosa es proporcional a buenos resultados en el cultivo. Laboratorio limpio (piso, paredes, equipos, baños, gavetas, etc.). Cerrar llaves de gas al finaliza el trabajo. Limpiar regularmente: baños maría, incubadoras y campana de flujo. Entrada al cuarto de cultivo, sólo personal autorizado. Limitar el acceso de visitas.

18 Estabilización del ph en el Medio de Cultivo. El balance ácido-base es mantenido por NaHCO 3, buffer y componente nutricional. Si [CO 2 ], el ph, lo cual es neutralizado por una elevada [NaHCO 3 ]. específica p/c medio. ph opt. =7.4. Sistema buffer dentro del medio de cultivo. NaHCO 3 disociado y CO 2. NaHCO 3 + H 2 O Na + + HCO H 2 O. Na + + H 2 CO 3 + OH - Na + + H 2 O + CO 2 + OH -. Depende del CO 2 atm. Cuando la presión parcial del CO 2 es baja, el equilibrio, el medio [OH - ] y se torna básico. Incubadora entrada de CO 2. La capacidad buffer del sistema : H + + HCO 3 H 2 CO 2 CO 2 + H 2 O. una elevada concentración de OH- causa OH - + H 2 CO 2 HCO 3 + H 2 O.

19 pk. H 2 CO 3 HCO H , 6.35* HCO 3 CO H * *Valor termodinámico

20 Descongelamiento de Células 1. Remover el tubo del nitrógeno líquido. Usar lentes. 2. Transferir el tubo a B.M. con 37 o C en y calentar rápidamente. 3. Limpiar tubo con alcohol al 70%. 4. Transferir la suspensión celular a tubo de centrífuga de 10 ml. 5. Agregar lentamente 10 ml de medio de cultivo. 6. Para remover el DMSO toxico, centrifugar 5 a 800 rpm. 7. Descartar el sobrenadante y remplazarlo por medio de cultivo fresco. 8. Transferir las células a botella de cultivo o caja Petri. 9. Cultivar en incubadora a 37 o C por 24 h. 10. Remover el medio, cada 3er. día.

21 37 o C Limpiar Et-OH 70% o C 10 ml 5 a 800 rpm

22 10 ml 37 o C 5-8% CO 2 humedad Ocular 10X Obj 10 X 20 X 32 X 200 X

23 Congelar Células Vivas. 1. Ajustar la concentración de células a 2-4 x 10 6 células / ml. 2. Preparar medio de congelación: el medio más DMSO 20 %. 3. Enfriar el medio de congelación. 4. Mezclar 900 ml de medio de congelación con 900 ml de susupensión celular en criotubo de 1.8 ml, [DMSO] final 10 %. 5. Sellar herméticamente el tubo. 6. Colocar el tubo en caja especial a -70 o C (ultracongelador). 7. Después de 2 h, transferir el criotubo al nitrógeno líquido.