APÉNDICE G. Identificación bioquímica de enterobacterias por el sistema API 20E

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1 APÉNDICE G Identificación bioquímica de enterobacterias por el sistema API 20E OBJETIVO: - Establecer la metodología en la identificación de enterobacterias por medio de pruebas bioquímicas estandarizadas y miniaturizadas. GENERALIDADES: El sistema API 20E (Biomériux 2010) es un sistema de pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negtivos, mediante 23 pruebas bioquímicas estandarizadas y miniaturizadas y una base de datos. Este sistema puede identificar 108 géneros y 104 especies de estas bacterias. La galería API 20E consta de 20 microtubos que contienen los sustratos deshidratados de las pruebas bioquímicas tradicionales. Se inoculan con una suspensión bacteriana que rehidrata los medios y después de la incubación se observan los cambios de color con o sin adición de reactivos (Tabla 1). La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la tabla de lectura y la identificación mediante la tabla de identificación Analytical Profile Index API 20E o el software APILAB. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES 1 caja de agar MacConkey a Colorantes y reactivos para tinción de Gram a Tiras para prueba de oxidasa a 1 tubo de 16 x 150 mm con 5 ml de solución salina isotónica 0.85% (P/V) b 1 tubo de 16 X 150 mm con solución de MacFarland (mezlcar 0.3 ml de BaCl 2 al 1% y añadir 9.7 ml de H 2 SO 4 al 1%) b Tiras API 20E (1 por colonia que se desee identificar) b Aceite mineral estéril b Agua para llenado de la cámara húmeda b Reactivo de cloruro férrico (TDA) c Reactivo de Kovac s (IND) c Reactivo para VP1 (potasa alcohólica al 40%) c Reactivo para VP2 (α-naftol) c MATERIAL - 1 pipeta Pasteur estéril b - Mechero a, b - asa microbiológica a, b

2 - Incubadora 35±2 C a, b - Bulbo o propipeta b NOTAS: a Material necesario al inicio de la técnica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la técnica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la técnica. PROCEDIMIENTO * Resembrar las colonias seleccionadas por estría en Agar MacConkey. * Incubar a 35±2 C durante 18 a 24 h. * Realizar tinción de Gram y observar características morfo-coloniales de la cepa con el objetivo de verificar pureza de la colonias seleccionadas. En caso de tener un carácter Gram-negativo y observar uniformidad en morfología y tamaño de bacterias proceder con el siguiente paso. * Efectuar la prueba de la oxidasa. En caso de ser negativa proceder con el siguiente paso. * Suspender el crecimiento obtenido en 5 ml de solución salina al 0.8% (P/V) (NaCl 0.8 %) hasta igualar turbidez del tubo 3 de MacFarland (preparar mezclando 0.3 ml de BaCl 2 al 1% y añadir 9.7 ml de H 2 SO 4 al 1%). * Proceder a inocular el sistema API 20E de acuerdo con la siguiente metodología: * Llenar el tubo y la cúpula de las pruebas CIT, VP, GEL con la suspensión bacteriana. * Llenar los tubos pero no las cúpulas de las demás pruebas. * Llenar la cúpula de las pruebas ADH, LDC, ODC, URE y H 2 S con aceite mineral estéril para obtener anaerobiosis. * Incubar a 35±2 C durante 18 a 24 h. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Pasado el tiempo de incubación consultar el Cuadro 1, para la adición de reactivos en los tubos respectivos y para la interpretación de resultados. Consultar el Cuadro 2 para obtener un número de identificación característico para cada especie. Consultar la Tabla de identificación del sistema API 20E (API 20E Analytical Profile Index, Bio-Mériux 2019) o el software APILAB (Bio-mériux), para determinar el género y la especie de la cepa aislada (En caso de no contar con la bibliografía mencionada, se podrá consultar el Bergey s Manual para la identificación de la cepa aislada con base en los resultados de las pruebas bioquímicas). Cuadro 1. Tabla de lectura para las pruebas bioquímicas del sistema API 20E. Pruebas Sustratos Reacciones/Enzimas Resultados Negativo Positivo

3 ONPG ortonitrofenol-βgalactósido β-galactosidasa incoloro amarillo (1) ADH arginina arginina dehidrolasa amarillo rojo/naranja (2) LDC lisina lisina descarboxilasa amarillo naranja ODC ornitina ornitina descarboxilasa amarillo rojo/naranja(2) CIT citrato sódico utilización de citrato verde pálido/amarillo azul-verde/verde (3) H 2 S tiosulfato producción de H 2 S incoloro/grisáceo depósito negro sódico URE urea ureasa amarillo rojo/naranja TDA triptofano triptofano deaminasa TDR/lectura inmediata después de agregar el reactivo TDA (5) amarillo marrón oscuro IND triptofano producción de indol IND/lectura 2 min después de agregar el reactivo IND (5) amarillo anillo rojo VP piruvato sódico producción de acetoína VP1 mas VP2/lectura 10 min después de agregar los reactivos VP1 y VP2 (5) incoloro rosado/rojo GEL gelatina de Kohn gelatinasa no ha difusión de pigmento negro difusión de pigmento negro GLU glucosa fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo MAN manitol fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo INO inositol fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo SOR sorbitol fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo RHA ramnosa fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo SAC sacarosa fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo MEL melibiosa fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo AMY amigdalina fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo ARA arabinosa fermentación/oxidación azul/azul-verdoso amarillo (1) Un amarillo muy pálido debe considerarse como positivo. (2) Un color naranja después de 24 h de incubación debe considerarse negativo. (3) La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis). La fermentación empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidación en la cúpula. (5) TDA:cloruro férrico; IND: reactivo de Kovac s; VP1: hidróxido de potasio 40%; VP2: α-naftol. Fuente: Manual del sistema de identificación para Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negativos mediante 23 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos, (1989).

4 Cuadro 2. Sistema de numeración de las pruebas positivas, para determinar el número de identificación de enterobacterias por el sistema de identificación bioquímica API 20E. VAL OR ASIG - NAD O a ONP G ADH LDC ODC CIT H 2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX sumar valores sumar valores sumar valores sumar valores sumar valores sumar valores sumar valores a Se le asigna este número si el resultado de la prueba fue positivo; si el resultado fue negativo el valor asignado es cero. Fuente: Giles M. (1995) Estudio sobre las interacciones microbianas importantes para el incremento de proteína durante la fermentación del pozol. Tesis de licenciatura. Facultad de Química, UNAM. 73 p.

5 BIBLIOGRAFÍA. Bio-mériux (1989) API 20E SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN PARA Enterobacteriaceae Y OTROS BACILOS GRAM-NEGATIVOS. No Biomériux S.A. (de.). Francia. 24 pp. Giles M. (1995) Estudio sobre las interacciones microbianas importantes para el incremento de proteína durante la fermentación del pozol. Tesis de Licenciatura. Facultad de Química, UNAM. 73 pp.