PRACTICA N 02: PROCESOS FERMENTATIVOS: PRODUCCION DE PROTEÍNA UNICELULAR O BIOMASA

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1 PRACTICA N 02: PROCESOS FERMENTATIVOS: PRODUCCION DE PROTEÍNA UNICELULAR O BIOMASA Capacidades a lograr: 1. Conoce y aplica técnicas de siembra, cultivo y cuantificación del proceso fermentativo para producción de proteína unicelular. GENERALIDADES Los microorganismos no tienen un ciclo de vida obligatorio, como otras formas de vida superiores. Cuando se les coloca en un medio nutricionalmente ideal o completo, la célula microbiana crece más y se divide para formar dos células, esto continúa con la producción de una población de células. Este crecimiento celular está basado en la habilidad de cepas para multiplicar el número de individuos viables (no considerando las células muertas o agonizantes) por lo que es importante el empleo de métodos de conteo de colonias y del número más probable. Aunque hay varias técnicas en uso para la estimación de las densidades y concentraciones celulares, no hay ningún método único que determine la masa y la cantidad en una sola operación. Entre los procedimientos ejecutados tenemos: Recuento microscópico en cámara de Neubauer En este método se coloca un volumen conocido de cultivo y el recuento se hace por microscopía y se puede calcular la cantidad de microorganismos por mililitro.

2 Recuento en placa Este método consiste en sembrar una alícuota diluida del medio de cultivo en una placa con medio de cultivo sólido, se incuba y cada célula viable va a formar una colonia. Peso Seco Consiste en secar volúmenes conocidos de cultivo hasta obtener un peso constante. Además de otros métodos como Turbidimetría (recuento basado en absorbancias) y el Número Más Probable (con base en estimaciones estadísticas). Estos métodos permiten una estimación aproximada del número de células. El crecimiento microbiano tiene las fases: a) Fase Lag o fase de adaptación. El microorganismo restituye su capacidad de desarrollar. Es importante resaltar que las cepas productoras provienen de cultivos preservados, donde su metabolismo es casi nulo.

3 b) Fase Log o exponencial, donde se produce la replicación microbiana y depende principalmente del suministro adecuado y suficiente de nutrientes que permita el desarrollo. Aquí se producen los metabolitos primarios. c) Fase estacionaria, donde se detiene la replicación y las células consumen la energía para sus funciones vitales. Aquí se producen los metabolitos secundarios. d) Fase de muerte celular, donde las células terminan su ciclo de vida. La reproducción y ciclo de vida celular decrece hasta detenerse. Para la producción de biomasa la fase exponencial debe ser corta y llegar rápidamente a la fase estacionaria donde se detiene el proceso. Es decir, lograr la máxima cantidad de células en el menor tiempo posible. Si se requieren metabolitos primarios, la fase Log debe ser de mayor tiempo. Pero si se requiere producir metabolitos secundarios, la fase estacionaria es el objetivo. La composición química de los medios de cultivo influye en el comportamiento de la curva de desarrollo o crecimiento microbiano (figura 1): Figura 1. Curva de Crecimiento Microbiano

4 Si el cultivo tiene todas las fuentes de nutrientes (carbono, nitrógeno, azufre, minerales) el proceso tiene comportamiento exponencial; acá se producen los metabolitos primarios. Pero si se limita un ingrediente, fuente de nitrógeno por ejemplo, se logra la fase estacionaria y es en esta fase donde se manejan los ingredientes para producir los metabolitos secundarios. La producción de biomasa es de importancia como alternativas de proteína como la unicelular SCP o "biomasa". Este término "proteína de origen unicelular" es aceptado para denominar de esa forma a células de bacterias, hongos y algas usadas como una fuente de proteína. Esta opción tiene ven tajas sobre otras proteínas ya que se obtiene de sustratos relativamente baratos, con alto rendimiento y de calidad nutricional. Además está sujeta a control lo que hace posible que su fabricación sea maximizada. Algunas ventajas de la proteína de microorganismos cultivada en biorreactores o sistemas similares, sobre la similar de plantas y animales se indican como sigue: 1. Los microorganismos tienen tiempos de generación cortos e incrementan rápidamente su masa; las bacterias y levaduras bajo condiciones de laboratorio alcanzan tiempos de generación entre un 0.5-2h o de 1-3h. 2. Los microorganismos poseen una concentración de proteína elevada entre un 10-50%. 3. La SCP es de alta digestibilidad no es tóxica y de buen sabor. 4. La producción de SCP se basa en sustratos relativamente baratos y abundantes como la celulosa, el AA o el petróleo, etc. 5. La producción de SCP se logra con relativa facilidad en un cultivo controlado independientemente de factores ambientales.

5 PORCENTAJE PROMEDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA PROXIMAL DE LA PROTEÍNA UNICELULAR EN BASE A SU PESO SECO. COMPUESTOS ORGÁNICOS (%) HONGOS FILAMENTOSOS ALGAS LEVADURAS BACTERIAS Proteína Lípidos Cenizas Ácidos nucleicos En la presente actividad práctica vamos a desarrollar el método de obtención de PROTEINA UNICELULAR o BIOMASA: EXPERIENCIA PRÁCTICA. Materiales, Reactivos y Equipos Levadura de panificación (húmeda) Glucosa Fosfato de Amonio DiHidrogenado Sulfato de Magnesio Fosfato potasico dihidrogenado NaCl (q.p.) Agar Estracto de Malta Agua destilada Matraz Erlenmeyer 500 ml Pipetas 10 ml Espátulas Varillas de agitación Termómetro 0-50 C Vasos de precipitación 100 ml Mechero de alcohol Pizeta Algodón copón Papel blanco Pabilo Mechero de alcohol Autoclave Incubadora Estufa

6 PROCEDIMIENTOS. 1. Medio de Cultivo Glucosa 20 g/l Fosfato de potasio dihidrog. 1 g/l Fosfato de amonio di hidrogenado 1 g/l Sulfato de Magnesio 0,5 g/l Minerales 0,5 g/l Agua destilada c.s.p. 1 L Preparar 500 ml del medio de cultivo en matraz Erlenmeyer, tapar con algodón, sellar con papel e hilo y llevar a autoclave a 121 C por 20 min. 3. Una vez frio el medio de cultivo, inocular la levadura (5% del volumen del medio de cultivo) en condiciones estériles: lejos de polvo, viento, con apoyo de mecheros; esto con la finalidad de eliminar la contaminación. La levadura debe estar rehabilitada por 12 horas en agar Extracto de Malta (fuente rica en nutrientes de alta calidad). Incubar a 30 C. 4. Observar y registrar el desarrollo microbiano. Dependiendo de la cepa inoculada, el proceso puede durar desde uno a más días. Luego filtrar el contenido y secar el filtrado en estufa a 60 C hasta peso constante. 5. Reporte los gramos de biomasa resultante.

7 CUESTIONARIO: 1. Qué es la PROTEINA UNICELULAR y cuál es su importancia? 2. En qué fase de desarrollo microbiano obtenemos la biomasa y cómo logramos mantenerla y evitar que el desarrollo avance a la siguiente fase? 3. Cuál es la razón de inocular previamente la levadura en Agar Nutritivo y que fase de desarrollo microbiano tiene esta etapa? 4. Los microorganismos requieren de fuente de carbono, nitrógeno, azufre, minerales, etc. Identifique cuáles son las fuentes en la presente práctica.

8 Grafique en orden secuencial el procedimiento descrito, indicando cada etapa del proceso.