ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO I: CONJUGACIÓN

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1 4. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO I: CONJUGACIÓN Objetivos Identificar al DNA como portador de la información genética Conocer los mecanismos por los que una bacteria puede adquirir un plásmido. Reconocer a la conjugación bacteriana como un fenómeno de transferencia horizontal de material genético. Entender el mecanismo por el cual se realiza la conjugación bacteriana. Introducción Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, covalentemente cerrados y generalmente, de tamaño pequeño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesarios para la viabilidad de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la sobrevivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos o a metales, por ejemplo. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación. Una bacteria sólo puede adquirir un plásmido a partir de otra bacteria que lo contenga, ya sea por transmisión vertical (es decir, de célula progenitora a célula hija) o por cualquiera de los tres mecanismos conocidos de transferencia horizontal de material genético. Estos son: la transformación, la transducción y la conjugación. En la transformación, el DNA liberado de una célula bacteriana entra a otra célula, generalmente de la misma especie. En la transducción, un virus bacteriano accidentalmente toma DNA del cromosoma o de un plásmido de la bacteria a la que ha infectado y lo inyecta a otras bacterias. La conjugación bacteriana es un proceso de transferencia de material genético en el que la información genética de un plásmido es transferido a otra célula (Figura 4.1). Este proceso, a diferencia de la transformación, tiene como condición esencial el contacto celular. A la célula que aporta el material genético se le llama donadora y a aquélla que lo recibe, receptora. No todos los plásmidos pueden transmitirse por conjugación, es decir ser conjugativos, solamente aquellos que poseen un grupo de genes denominados genes tra. Dentro de este grupo de plásmidos se encuentra el factor de fertilidad o plásmido F de E. coli. El plásmido F confiere a la célula bacteriana la capacidad de conjugarse con otra célula que no lo posea. Este plásmido se

2 presenta en una sola copia por cromosoma bacteriano y tiene la capacidad de integrarse a éste. Cuando se integra suprime su sistema de replicación y se replica como parte del cromosoma. El plásmido F contiene más de 40 genes tra, la mayoría de los cuales son necesarios para la construcción de un organelo llamado pili sexual o pili F constituido por una proteína, la pilina, codificada por uno de los genes tra. El Pili F es necesario para promover el contacto entre las bacterias donadora y receptora y para la formación de un puente citoplasmático por donde pasa el material genético. La transferencia se inicia a partir de un sitio específico en el plásmido y que forma parte de los genes tra, denominado orit. Figura 4.1. Conjugación bacteriana. Paso del plásmido F de una célula donadora a una receptora a través del conducto proteico denominado pili. Al centro se muestra cómo sólo una de las hebras del DNA del plásmido se inserta en la célula hospedera, por lo que la DNA polimerasa de cada una de las bacterias se encarga de sintetizar la hebra faltante. Al final ambas células contienen el plásmido F. Algunos plásmidos no son capaces de llevar a cabo la conjugación por sí mismos, pero pueden ser transferidos (plásmidos movilizables) a otras bacterias cuando coexisten con plásmidos con genes tra, debido a que contienen un grupo de genes denominados genes mob, los cuales incluyen un sitio orit, pero carecen de otros genes necesarios para la conjugación, incluyendo los que codifican para la formación del pili. En relación al plásmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas: Cepa F -. Célula bacteriana que no posee un plásmido F, y que actúa como célula receptora en la conjugación. Cepa F +. Célula bacteriana que posee un plásmido F independiente del cromosoma bacteriano, actúa como célula donadora en la conjugación y transfiere al plásmido F a la célula receptora (F - ) transformándola en célula F +. Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plásmido F integrado a su cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su cromosoma (célula donadora) y por ello confieren alta

3 frecuencia de recombinación. No transfieren el plásmido F, por lo que al término de la conjugación la célula receptora permanece como F -. Cepa F. Célula bacteriana que posee un plásmido F extracromosómico, pero que antes estuvo integrado al cromosoma y que se escindió llevando consigo genes bacterianos. Actúa como célula donadora en la conjugación y transfiere el factor F junto con los genes bacterianos, transformando a la célula receptora en una célula F, la cual será un diploide parcial o merocigoto. Esto quiere decir que tendrá dos copias de los genes bacterianos que están presentes en el plásmido F. A ese tipo de transferencia se le conoce como sex-ducción. Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una célula F - en un tiempo constante. Se calcula que la transferencia de todo el cromosoma de Escherichia coli de una bacteria a otra tarda aproximadamente 100 minutos.esta característica ha sido utilizada en el mapeo genético, ya que permite localizar un determinado marcador genético (es decir, una característica determinada) en un tiempo dado. En esta práctica se comprobará la conjugación bacteriana mediante la transferencia de un marcador genético: la resistencia a la kanamicina. El marcador genético de selección que se utilizará para la cepa receptora será la resistencia a la estreptomicina. Investiga: Qué es y para qué se utiliza un marcador genético de selección? Material biológico Cultivo de E. coli JM1452Str R (cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC. Cultivo de E. coli W3110/F KmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC. Materiales y equipo 1 tubo 13 X 100 mm con 1 ml de caldo Luria estéril 5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 g/ml) 2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml) 100 palillos de madera estériles 1 asa bacteriológica 1 propipeta 1 mechero Incubadora a 37 C Baño María a 37 C Refrigerador a 4 C Por grupo para controles de las cepas 1 caja Petri con medio Luria-agar 2%-estreptomicina (25 g/ml) 1 caja Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)

4 Desarrollo de la práctica 1. En condiciones estériles tomar el tubo de 13X100 con 1 ml de caldo Luria estéril y hacer la siguiente mezcla de conjugación: 0.5 ml del cultivo de E. coli JM1452Str más 0.2 ml del cultivo E. coli W3110/F KmTn3 (Figura 4.2). 2. Incubar el tubo a 37ºC SIN AGITACIÓN durante 30 min. 3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes. Marcar la zona 1 como bacteria receptora, la zona 2 como conjugación y la zona 3 como bacteria donadora. Colocar una gota pequeña de cada cultivo en el sitio correspondiente y dejar que se absorba. Nota: Si el profesor lo considera necesario, en lugar de colocar una gota del cultivo se puede sembrar por estría cada cultivo, lo anterior ofrece la ventaja de adelantar un día. 4. Incubar a 37ºC durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento en la zona de conjugación. Refrigerar a 4ºC. 5. Testigo por grupo: Dividir una caja petri con Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina y una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Sembrar por estría las cepas donadora y receptora en cada mitad de las cajas respectivamente. Incubar a 37 C durante 24 h. Al observar crecimiento refrigerar las cajas. 6. Después del tiempo de incubación trabajar con la caja del paso 3. Si no se sembró por estría en el paso 3, tomar una asada de las zonas receptora y de conjugación y sembrar por estría en una caja petri con Luria-agar- 2% sulfato de estreptomicina, cada una en una caja diferente. Incubar a 37ºC durante 24 h. 7. De las colonias aisladas, parchar colonias de cada caja en una caja Petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina y 50 colonias en otra de Luriaagar 2%-estreptomicina y después la réplica en la caja de Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Parchar consiste en tomar bacterias de una colonia aislada y picarla con un palillo en otra caja, posteriormente el resto de las bacterias que quedaron en el palillo son usadas para picar una caja con otro medio de cultivo para así transferir la bacteria, por lo que dos cajas de cultivo en placa contendrán a la misma bacteria y en la misma posición. En la práctica una colonia se transferirá con el palillo del cultivo de bacterias aisladas a dos diferentes cajas Petri con medio, empezando por la que contiene el antibiótico estreptomicina seguida por la de Kanamicina. Para facilitar y agilizar el parchado, marcar divisiones por la parte de atrás de las cuatro cajas o bien pegar una hoja cuadriculada en el exterior y por debajo de la caja (ver figura 4.2). 8. Incubar a 37ºC durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento. Observar y analizar los resultados. Refrigerar las cajas. 9. Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes.

5 0.5 ml Luria- Estreptomicina 0.2 ml E. coli JM1452Str cepa receptora Mezcla de conjugación E. coli W3110/F KmTn3 cepa donadora Incubar 30 min a 37 C sin agitación Luria-Estreptomicina Incubar 24 h, 37 C Sembrar por estría las cepas receptora y transconjugante en Agar Luria-estreptomicina (se necesitan colonias aisladas para el siguiente paso) Incubar 24 a 37 C Cepa receptora Cepa transconjugante Marcar las cajas Parchar 50 colonias Luria- Kanamicina Luria-Estreptomicina Luria-Estreptomicina Luria-Kanamicina Figura 4.2. Esquema experimental de conjugación bacteriana. Producción de una cepa transconjugante a partir de una cepa receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la información genética para la resistencia a kanamicina. No olvidar hacer los testigos.

6 Cuestionario 1. Qué es un plásmido? 2. Cuáles son los mecanismos de transferencia horizontal de material genético en bacterias? 3. Qué es la conjugación? 4. Qué diferencia existe entre la conjugación y los otros mecanismos de transferencia horizontal de material genético? 5. Cuáles son las principales características del plásmido F y qué genes contiene? 6. Cuáles son los genes del plásmido F necesarios para la transferencia de material genético por conjugación y para qué codifican? 7. De acuerdo al plásmido F cuántos tipos de cepas bacterianas se conocen? y qué diferencia existe entre ellas? 8. Señale qué tipo de transconjugantes se obtienen en cada una de las siguientes cruzas : a) F + X F - b) F X F - c) Hfr X F - 9. Qué características tienen las cepas empleadas en la práctica? 10. Por qué tanto la cepa donadora como la receptora tienen un marcador de selección?. 11. Hubo crecimiento de las cepas empleadas en la práctica en las cajas controles con antibióticos? Por qué son importantes estas cajas control? 12. Por qué se parchan la cepa receptora y la transconjugante tanto en medio con estreptomicina como kanamicina? Qué resultados se obtuvieron en esas cajas? 13. Cómo se comprobó la conjugación en la práctica? Qué porcentaje de bacterias transconjugantes se obtuvo? 14. Cuál es el genotipo de la cepa transconjugante obtenida en la práctica? 15. Qué diferencias existen entre un plásmido conjugativo y uno movilizable? 16. La conjugación puede realizarse entre las bacterias Gram positivas o sólo ocurre en las bacterias Gram negativas? 17. Con qué frecuencia y dónde se realiza la conjugación en forma natural? 18. Cuál es la importancia biológica de la conjugación? 19.Indique los mecanismos por los que se da la resistencia de las bacterias a los antibióticos utilizados en la práctica. 20. Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos adquiridos al realizar esta práctica? Referencias Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA pp 467. Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA pp Genética General, Manual de prácticas de laboratorio. Regulación genética en el operón lac. Facultad de Química, UNAM. Ciudad Universitaria. México, 2002.