O Existen otras técnicas;

Transcripción

1 O Existen otras técnicas; O White- Blue Screen ( azul blanca). Se clona el DNA en un si>o de restricción en el gen lacz. O El gen lacz codifica ß- galactosidasa(ß- gal) una enzima que degrada lactosa. Cuando el gen se interrumpe por un gen insertado, el gen lacz es incapaz de producir ß- gal funcional. O Las bacterias transformadas se siembran en placas que con>enen un an>bió>co (ampicilina).

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3 Las bacterias no transformadas no pueden crecer en presencia de ampicilina porque les falta el DNA del plásmido que con>ene un gen de resistancia a la ampicilina(ampr). El agar >ene un sustrato cromogénico(que produce color)para ß- gal llamado X- gal(5- bromo- 4- cloro- 3- indolil- ß- Dgalactopiranósido)

4 O X- gal es similar a la lactosa en estructura y se vuelve azul cuando lo rompe ß- gal. O Las bacterias no recombinantes, las qe con>enen un plásmido que se ligó consigo mismo sin DNA insertado, con>enen un gen lac Z funcional, producen ß- gal y se vuelven azules. O Las recombinadas con>enen plasmido con DNA extraño insertado dentro del gen lac Z, no se produce ß- gal y no pueden metabolizar X- gal

5 Clones Las colonias que con>enen plásmidos recombinate son clones. Clones- células bacterianas gené>camente idén>cas cada una conteniendo copias del plásmido recombinante.

6 Clonación de Genes Humanos Si el fragmento de DNA es un gen que codifica para un producto proteico, se puede u>lizar las células bacterianas para sinte>zar el producto proteico del gen clonado. (expresión de proteínas)

7 Insulina- Primer producto gené>co humano de la tecnología de DNA recombinante. Humulina- (1982). Primer producto aprobado por FDA

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9 Que necesita un buen vector O Tamaňo O Origen de replicación (ori) O Alto número de copias O Si>o de clonación múl>ple (MCS) O Polylinker- Fragmento de DNA con muchas secuencias de reconocimientos para enzimas O Genes marcadores que se puedan seleccionar O Iden>ficación y selección

10 Secuencias del promotor de RNA polimerasa Se u>lizan para la transcripción in vivo e in vitro por la RNA polimerasa In vivo permite replicación a par>r de genes cloados. In vitro permite crear sondas Secuencias de oligonucleó>dos para secuenciar DNA

11 Tipos de vectores Vectores plásmidos bacterianos Vectores bacteriófagos Vectores cósmidos Vectores de expresión BAC (Cromosomas ar>ficiales bacterianos Cromosomas ar>ficiales de levaduras (YAC) Vectores Ti

12 Plásmidos Son los vectores más utilizados. Son sencillos para lograr transformación. Uno de los primeros vectores plasmídicos (pbr322), se diseňo para tener genes de resistencia y varios si>os de restricción. Bajo número de copias.

13 Bacteriófagos El cromosoma lambda es lineal de aprox. 49kb de tamaño. Tiene extremos cohesivos. Bacteriófago se replica mediante un ciclo lítico. Ventaja clonación de fragmentos más grandes 25kB. Vectores de expresión de proteínas.

14 cósmidos Es un vector circular Contienen extremos cohesivos de DNA lambda un origen y genes de resistencia. Recombinante se ven mediante selección antibiótica.

15 Vectores de expresión Permiten la expresión de altos niveles de proteína eucariotas dentro de células bacterianas. No siempre es posible expresar una proteína funcional e bacterias. Vectore de expresión se utilizan con Bacillus subtilis por la capacidad de secretar proteínas.

16 BAC (Cromosomas ar>ficiales bacterianos) Grandes plásmidos de bajos números de copias. Contienen genes que codifican para el factor F (controla replicación bacteriana) Pueden aceptar insertos enter kb. No se puede usar para expresión de proteínas.

17 Cromosomas ar>ficiales de levaduras (YAC)

18 Cromosomas ar>ficiales de levaduras (YAC) O Pequeños plásmidos que han crecido en E.coli y han sido insertados en células de levaduras. O YAC versión en miniatura de un cromosoma eucariota. O ORI, Marcadores de selección, telómeros y un centrómero. O Clonan grandes fragmentos de DNA (200kb- 2mb)

19 Vectores Ti Aislados de Agrobacterium tumefaciens Al entrar en la planta hospedera, un fragmento de DNA (T-DNA) del plásmido Ti se inserta en el cromosoma hospedero. Se utilizan para transferir genes a plantas. Codifica la síntesis auxina,que debilita la pared.

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