Genética bacteriana II. Genética de bacteriófagos

Transcripción

1 Genética bacteriana II Genética de bacteriófagos

2 Generalidades de Virus Tamaño nm DNA o RNA, de cadena simple o doble Cubierta de proteínas con o sin lípidos Forma icosaédrica, de varilla, o cabeza y cola Virus de la influenza (200 nm)

3 Clasificación de fagos por su estructura. Icosahédricos sin cola (φx174) Icosahédricos con cola (λ) Filamentosos (M13) Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside de proteína

4 El genoma de los fagos RNA simple cadena(ms2, Qß) RNA doble cadena(phi 6) DNA simple cadena(phi X174, fd, M13) DNA doble cadena(t3, T7, lambda, T5, Mu, T2, T4) Estos ácidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son sintetizadas por proteínas del fago. En los fagos T-pares,el genoma no contiene citosina sino 5'-hidroximetilcitosina, mientras que en otros tipos de fago alguna de las bases está parcialmente sustituida.

5 Fago libre Componentes del Fago Bacteriofago T4 virulento Cabeza Cuello y collar Fago infectando Centro Vaina Placa Basal Fibras

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7 Ciclo LíticoL Ciclo de Replicación del Bacteriofago T4 1. Adsorción del fago a receptores en la superficie de la bacteria (proteínas transportadoras de maltosa o de Fe 2+ ) 2. Inyección del material genético viral 3. Transcripción del DNA del bacteriófago y producción de proteínas virales 4. Replicación del material genético viral 5. Empaquetamiento del DNA dentro de la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura 6. Lisis y liberación de las partículas virales

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9 Halos ó placas de lisis de los fagos

10 Ciclo Lisogénico (Fagos temperados) 1. Una molécula de DNA del fago es inyectada a la bacteria. 2. Transcripción de genes necesarios para la integración. 3. El DNA del fago se inserta en el cromosoma bacteriano. (Integración) 4. La bacteria replica su DNA (y el del fago) y se divide normalmente. 5. El fago insertado se denomina profago y a la bacteria lisógeno. 6. La bacteria es ahora inmune a la infección de otros fagos.

11 Integración del DNA del fago al cromosoma bacteriano El cromosoma del bacteriófago lambda (λ) en estado libre es circular. El sitio de integración λ es una región del cromosoma que se alinea en un sitio del cromosoma bacteriano (entre los genes gal y bio). Ocurre un entrecruzamiento recíproco entre el fago circular y el cromosoma bacteriano resultando en la integración. Esta integración es mediada por los genes del bacteriofago y no por el sistema de recombinación de la bacteria. Al DNA del fago integrado al cromosoma se le llama profago.

12 Bacteria lisogénica portadora de Profago

13 Molécula lineal de DNA del bacteriofago λ

14 Integración de λ al cromosoma bacteriano

15 Bacteriófago lambda (λ)(fago temperado) Ciclo lisogénico Ciclo lítico

16 TRANSDUCCIÓN Transferencia de material genético entre bacterias a través de un bacteriófago

17 Transducción Transferencia de material genético bacteriano por los virus de bacteria (fagos) phe trp tyr met his WT

18 TRANSDUCCIÓN Profago Cromosoma bacteriano Inducción del ciclo lítico La escición del DNA del fago acarrea DNA cromosomal Replicación del fago Lisis celular y liberación del fago La célula receptora adquiere nuevos genes Integración del DNA del fago al cromosoma El fago infecta a la célula receptora

19 Transducción Transducción generalizada Transducción especializada

20 Transducción generalizada

21 Transducción especializada

22 Durante la transducción se pueden mapear genes Células donadoras: arg + ; met +, str s Infección con el fago P1. Ciclo lisogénico. Integración Ciclo lítico y cosecha de fagos. Mezclar los fagos con la bacteria receptora: arg - ; met - ; str r

23 Selección fenotípica de las bacterias receptoras. Ciclo lisogénico del bacteriofago

24 Transposones (Elementos genéticos móviles) m La transposición es otro tipo de recombinación de DNA en el cual un elemento transponible o transposón se mueve de una molécula de DNA a otra (recombinación ilegítima). Fueron descubiertos originalmente en maíz por Barbara Mc Clintock y su presencia se ha documentado también en otras especies, desde bacterias hasta humanos.

25 Descubrimiento de los transposones eucariontes Elementos de Control Barbara Mc Clintock, 1951

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28 Tipos de transposones Secuencia de Inserción o Elemento de Inserción (IS): contiene una secuencia central con el gen de la transposasa y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso no nesariamente idéntica, aunque muy parecida. Cuando un transposón simple se integra en un determinado punto del DNA aparece una repetición directa de la secuencia diana (5-12 pb). Transposón Compuesto (Tn): contiene un elemento de inserción (IS) en cada extremo, en orden directo o inverso y una región central que además suele contener información de otro tipo. Por ejemplo, los Factores de transferencia de resistencia (RTF) poseen información para resistencia a antibióticos (cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina, etc.).

29 Elemento Características de algunos elementos IS Longitud Repetición terminal invertida Repetición directa de la diana Selección de la diana IS1 786 pb 23 pb 9 pb Regional IS pb 41 pb 5 pb Zona caliente IS pb 18 pb pb AAAX 20...XTTT IS pb 16 pb 4 pb Zona caliente Características de algunos Transposones compuestos (Tn) Elemento Longitud Marcador genético (resistencia) MÓDULOS TERMINALES IS Orientación Relación entre ambos Tn pb Tetraciclina IS 10 Invertida Divergencia 2.5% Tn pb Kanamicina IS 5 Invertida Difieren en 1 pb Tn pb Kanamicina IS 903 Invertida Idénticos Tn pb Cloranfenicol IS 9 Directa Idénticos (?)

30 Tanto los elementos IS como los transposones (Tn) tienen que estar integrados en una molécula de DNA, que contenga un origen de replicación, ya sea en el cromosoma principal bacteriano o en un plásmido, nunca se encuentran libres. Cromosoma de E. coli Algunos elementos pueden estar en varias copias

31 Transposones en procariontes Secuencias de inserción (IS) Frecuencia global de transposición: Frecuencia individual de transposición: Reversión de la transposición:

32 Transposones El tamaño de los transposones varía entre 10 3 a 10 4 pb dependiendo del tipo de transposón. La secuencia íntegra del transposón se puede insertar en un sitio particular del cromosoma. La transposición involucra recombinación entre secuencias no relacionadas (recombinación ilegítima) que son los extremos flanqueantes del transposón y el sitio del cromosoma donde se insertó.

33 Dos formas de transposición Replicativa Conservativa

34 Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y une los extremos del transposón. Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son invertidas, son idénticas. Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún antibiótico. Kan S Kan R Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb. Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp. Tn7: 14,000 pb y regiones flanqueantes (secuencias repetidas invertidas de 30 pb). Resistencia a Strp, Spec. Tn10: 9,300 pb y regiones flanqueantes de 1,300 pb. Genes de resistencia a Tet.

35 Mecanismo de transposición (recombinación n ilegítima) Repetidos directos (5-9 pb)

36 Transposición n conservativa Unión de la transposasa a la región flanqueante Formación del asa (complejo sináptico). Los extremos del transposón se acercan. Corte del DNA y escición del transposón Unión del transposón al DNA blanco La transposasa cataliza la inserción del transposón al DNA blanco.

37 Transposición n replicativa Transposasa Resolvasa

38 Transposones de eucariontes Retrotransposones Transposones de DNA

39 Los retrovirus se integran al DNA provirus

40 Los transposones pueden causar reordenamientos y cambios en los genomas

41 Transposones Duplicación de DNA Transferencia de DNA Los Virus Evolución de genomas

42 Uso de los transposones para generar una colección de mutantes 1.Para introducir inserciones de Tn5 al azar en el cromosoma de E. coli, se usa un vector de fago lambda: λ Pam int - ::Tn5 2.Cuando este fago infecta células Kan S, el DNA del fago no se puede replicar ni integrar, así que la única manera de que E. coli se vuelva Kan R es que el transposón Tn5 se inserte en algún sitio del cromosoma. Esto va a ocurrir en aprox. 1 de cada 100,000 células infectadas. 3. Si se infectan 2 x 10 9 células, se obtendrán aprox. 2 x 10 4 colonias Kan R. Cada una tendrá una inserción de Tn5 en un sitio distinto del cromosoma. Si en el genoma de E. coli hay unos 5,000 genes, es probable que se tenga una colección con inserción de Tn5 en casi todos los genes.

43 La transferencia horizontal de genes entre distintas especies, e incluso géneros de bacterias

44 Mecanismos de resistencia a antibióticos ticos y su transmisión 1. Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram- (capa de LPS). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en plásmido o en cromosoma. 2. Modificación e inactivación del antibiótico. β-lactamasa, enzimas modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa. 3. Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con menor afinidad por las β-lactamas. 4. Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a sulfonamidas.

45 1. Cuatro cepas Hfr de E. coliprocedentes de la misma cepa F + transfieren los siguientes marcadores en el orden: Cepa 1: M Z X W C Cepa 2: L A N C W Cepa 3: A L B R U Cepa 4: Z M U R B Cuál es el orden de estos marcadores en la cepa F + original? 2. Se realiza un cruzamiento entre una cepa Hfr arg + bio + leu + y una cepa F arg bio leu. Experimentos de conjugación interrumpida demuestran que arg + entra en el receptor en último lugar, de modo que se seleccionan recombinantes arg+ para determinar la presencia de bio + y leu + encontrando los siguientes números: arg + bio + leu arg + bio + leu 8 arg + bio leu + 0 arg + bio leu 48 Cuál es el orden de estos marcadores? Cuáles son las distancias en unidades de mapa?