Clase teórica III Genética y clonación

Transcripción

1 Especialidad en Microbiología a Clínica Módulo: Biología a Molecular Aplicada al Laboratorio de Microbiología UCA Clase teórica III Genética y clonación Lic. M. Paula Quiroga

2 Los temas de hoy: 22/4: Conceptos generales de: CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA A. Mutaciones y mutantes. B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos. C. Adquisición de material genético exógeno. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE A. Enzimas utilizadas en biología molecular. B. Vectores de clonado y de expresión. C. Construcción de bibliotecas genómicas.

3 mutaciones Espontáneas (sin mutagénicos) Tasa de mutación (10-4 y ) Sustitución de bases: puntuales Mutaciones con cambio de marco: Deleciones Inserciones Mutaciones inducidas:

4 Estructura del ADN Cromosoma bacteriano Procariotas ADN doble cadena (1mm long) circular cerrado Condensado y ordenado (supercoiled o superenrollado) Origen de replicación Genes organizados en operones No contiene histonas

5 Plásmidos Tamaño o de 1 a 400Kb Cantidad variable de copias en una célulac Origen de replicación n propio Pueden integrase al cromosoma Pueden movilizarse a otros genomas

6 Adquisición de material genético exógeno: Conjugación Plásmidos y conjugación: n: Conjugativos Movilizables No movilizables

7 Adquisición de material genético exógeno Integración Transposición

8 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro

9 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in in vitro Nucleasas -Endonucleasas - Exonucleasas Polimerasas - DNA Polimerasas - RNA Polimerasas Otras enzimas modificadoras - Fosfatasas, ligasas, metilasas, etc.

10 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Nucleasas 3 5 Endonucleasas Sitio específicas: enzimas de restricción Cortes en uniones fosfodiester Genera 3 OH 3 y 5 PO45 cohesivos o romos Cortan en la zona de reconocimiento 5 3

11 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Endonucleasas Sitio Específicas 2 tipos de cortes COHESIVOS ROMOS

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14 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Nucleasas Endonucleasas No Sitio específicas (Cortes en uniones fosfodiester)

15 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Endonucleasas No Sitio Específicas Mung bean: : corta ADN simple cadena Nucleasa S1: : corta regiones simple cadena de ADN DNasa I: corta ADN doble o simple cadena dejando extremos romos o con 1 o 2 nt. Uso: identificación n de regiones del ADN unidas a proteínas RNAsas 2 tipos más m s comunes A: degrada todo tipo de ARN H: corta híbridos h ARN:ADN

16 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Exonucleasas Cortan los ácidos nucléicos sólo s por extremos Funcionalidad: proof reading en ADN

17 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Nucleasas Exonucleasas DNA doble cadena DNA simple cadena Bal 31 (degrada extremos dc 3 y 5 dejando extremos romos); utilizada para deleciones progresivas Exo III (degrada DNA dc del 3 dejando extremos recesivos rellenables) Exonucleasa lambda (degrada DNA dc del 5 dejando extremos recesivos no rellenables) ExoVII (remueve oligonucleótidos en 5 o 3 de DNA sc)

18 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Promotor específica ARN polimerasa Polimerasas de fagos T7, T3 y T6 Polimerasas Actividad 5 a a 3 3 ADN polimerasa Fragmento Klenow DNA polimerasa 1 de E.coli T4 DNA polimerasa T7 DNA polimerasa Polimerasas termoestables Trasncriptasa reversa Terminal transferasa

19 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Polimerasa Termoestables Taq polimerasa Vent polimerasa Pfu polimerasa Pfx polimerasa Uso en PCR

20 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Ligasas Metilasas Otras enzimas modificadoras Fosfatasas Kinasas

21 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Enzimas modificadoras del DNA Fosfatasas Remueven grupos fosfatos de los extremos 5 5 de ADN Uso: prevención n de ligación n de extremos complementarios y preparación n del ADN para marcado radiactivo P CCC-OH OH-GGG GGG-OH OH-CCC P Fosfatasa Alcalina: Calf intestine (CIP) Bacteria (BAP) Shrimp (SAP)

22 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Enzimas modificadoras del DNA Kinasas Agrega grupos fosfatos a los extremos 5 5 de ADN Uso: marcado radiactivo en el extremo 5 5 T4 Polinucleótido kinasa

23 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Enzimas modificadoras del DNA Metilasas Metilan bases dentro de una secuencia específica Dam Dcm

24 ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN N DEL ADN in vitro Enzimas modificadoras del DNA Ligasas CCCGGG GGGCCC Cataliza uniones covalentes entre nucleótidos T4 DNA ligasa para extremos romos o cohesivos E.coli DNA ligasa para nicks

25 METODOLOGÍA A DEL ADN RECOMBINANTE Ligación

26 Que significa clonar? Utilizar tecnología de ADN especializada o tecnología recombinante para producir múltiples copias exactas de un gen u otro segmento de ADN. ADN que se introduce en diferentes células huésped utiliza su maquinaria de replicación. Células huésped: bacteria (mas común), levaduras y células mamíferas. Objetivo: amplificación y/o expresión

27 Como clonar Obtener el fragmento de ADN a ser estudiado y prepararlo para insertarlo en un vector vector Capacidad de inserción: 12kb para vectores bacterianos. 1Mb para vectores de levaduras. Molécula de ADN proveniente de virus, bacterias o levaduras

28 Células Huésped Levaduras Saccharomyces cereviseae, Pichia pastoris, etc. Células mamíferas Líneas celulares como CHO ( cél. Ovario Hamster) Bacterias GRAM NEGATIVAS (E. coli, P.aeruginosa) GRAM POSITIVAS (Bacillus subtilis, S.aureus, Streptommyces)

29 Células Huésped: Bacterias Sistema más desarrollado Cepas recombinantes con deleciones en el genoma que permiten: seleccionar genotípicamente, seleccionar fenotípicamente, estudiar expresión de una proteína, estudiar la respuesta celular, etc.

30 VECTORES RECOMBINANTES Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de una célula huésped SISTEMAS BACTERIANOS Plásmidos Inserción de hasta 10kb Sistema más común Fagos Cósmidos Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb) Tipo I (T1, capacidad 23kb) Capacidad de 44kb Plásmidos con sitios cos BAC Capacidad de 300kb Cromosoma artificial de bacterias

31 Bacteriófagos

32 Fagos Utiliza la capacidad lisogénica Mayor eficiencia de transformación

33 Cósmidos Propagación similar a la de un plásmido Sitios cos derivados de fagos que envuelven el ADN Introducción del ADN en bacterias por transformación o empaquetamiento como fago

34 plásmidos utilizados como vehículos de clonado Vectores de clonado o de expresión Multicopia: bajo número (15) o alto número (>50). Con sitios de corte únicos para el clonado. Polylinker o MCS (multiple cloning sites). Con marcador fenotípico, fácilmente detectable. Pequeño tamaño (entre 2.5-7kb).

35 Plásmidos

36 VECTORES VECTORES DE CLONADO VECTORES DE EXPRESIÓN

37 VECTORES de CLONADO Genes de resistencia a antibióticos (selección) Origen de replicación Sitios de corte de endonucleasas, dispersos

38 VECTORES de CLONADO Marcador de selección Marcador de selección

39 VECTORES de EXPRESIÓN Polilinker o MCS Selección Origen de replicación Región Reguladora (promotor inducible)

40 VECTORES SHUTTLE Dos marcadores de selección Dos orígenes de replicación Sitios de corte único para el clonado

41 VECTORES RECOMBINANTES SISTEMAS EUCARIÓTICOS Estudio del genoma eucariotico huésped eucariótico. in vivo,, necesita Vectores Integrativos: disrupción génica, reemplazamiento génico Lineales Cromosomas Artificiales de levaduras (YACs) Plasmídicos (derivados de Ti) Virales (SV40, papiloma bovino, retrovirales)

42 VECTORES RECOMBINANTES SISTEMAS EUCARIÓTICOS Vector viral: SV40 Usado para infectar células tumorales YAC capacidad de 1Mb de genoma, pero baja eficiencia Vector plasmídico para Eucariotas: plásmido Ti, circular de Agrobacterium tumefaciens, permite a las bacterias infectar plantas

43 Como clonar???

44 PRODUCCIÓN N DE UNA PROTEÍNA

45 Gen de interés ADN cromosomal

46 Extracción de ADN Recuperación del fragmento de interés (idealmente x PCR)

47 ELECTROFORÉSIS

48 Producto de PCR ADN muy limpio!!! Insertar en el vector El vector debe estar listo!!!

49 ADN extraído Digestión del ADN plasmídico con enzima de restricción ADN digerido ADN no digerido Tratar con Fosfatasas

50 Extremo del ADN genómico digerido Extremo del ADN plasmídico digerido Ligación????

51 Ligación

52 INSERCIÓN N DE ADN EN UN PLÁSMIDO

53 INTRODUCCIÓN N DEL PLÁSMIDO EN UNA BACTERIA Transformación Células debilitadas que permiten el acceso de ADN foráneo: T. Química (CaCl 2 ) T. Física (electroporador)

54 INTRODUCCIÓN N DEL PLÁSMIDO EN UNA BACTERIA

55 Una vez obtenida la colonia Corroborar fenotípica o genotípicamente la presencia del fragmento insertado

56 GENÓMICA Estructural Funcional Conjunto de estrategias y tecnologías empleadas para la caracterización molecular del genoma

57 Biblioteca de cdna Construida a partir de ARNm Contiene las regiones codificantes del genoma Depende de la célula de origen y su estadio

58 Bibliotecas Genómicas Fragmentos de ADN que representan todo el genoma Vectores: plásmidos o fagos lambda (fagos: recomendado por mayor eficiencia y mayor capacidad). También n YAC y cósmidos. c Reconocimiento de fragmentos por screening con regiones conocidas Proyectos genoma

59 Bibliotecas Genómicas Digestión de un genoma completo Reemplaza el paso de PCR inicial

60 Bibliotecas Genómicas Corte con una sola enzima

61 Bibliotecas Genómicas Análisis de Secuencias Armado de estructuras mediante ensamblado

62 Contigs

63 Genomas

64 Virus Grupos I II III IV V VI VII Contienen dsdna viruses ssdna viruses dsrna viruses (+)ssrna viruses (-)ssrna viruses ssrna-rt viruses dsdna-rt viruses ss: single-stranded, ds: double stranded RT: reverse transcribing Pueden ser líticos o lisogénicos (Herpes simplex) Contiene ADN o ARN simple o doble cadena o ambos (CMV) Tamaño del genoma ronda en 5Kpb a 5000Kpb Virus de ARN poseen genomas más chicos que virus de ADN (asociado a la fidelidad de la polimerasa)

65 Bacteriófagos Reconocen receptores en bacterias Pueden ser líticos o lisogénicos Contiene ADN o ARN simple o doble cadena Tamaño del genoma ronda en 170kbp

66 Bacterias Cromosoma Plásmidos Genoma de E. coli

67 Tamaños 600Kpb a 10Mpb Mycoplasma genitalium contiene el genoma más chico Patógeno intracelular obligado Aproximadamente 250 genes esenciales Las mayoría de las bacterias tienen su genoma organizado Genomas organizados en islas

68 Hongos Levaduras Fermentación Obtención de biomasa Utilizado en procesos relacionados con los alimentos Utilizado en la producción n de fármacosf Modelo eucariótico para biotecnología a médicam Altamente avanzada por el estudio de Saccharomyces Modelo Eucariótico Genoma 13Mpb 6000 genes aprox.

69 MUCHAS GRACIAS!!!