REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Microbiología de los Alimentos Ingeniería en alimentos
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- María del Pilar Cortés Cuenca
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1 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Microbiología de los Alimentos Ingeniería en alimentos 2015
2 Desarrollada por Kary Mullis en 1986 Técnica in vitro que permite amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN, la cual se encuentra flanqueada por 2 secuencias de ADN conocidas Se basa en el mecanismo de replicación in vivo de ADN: El ADN bicatenario se desenrolla pasando a monocatenario, duplicándose y volviéndose a enrollar.
3 Pasos para realizar una PCR 1) Extracción del ADN deseado 2) Preparación de la mezcla de reacción(master mix) 3) Separación de master mix en alícuotas y agregado del ADN de interés 4) Amplificación en Termociclador 5) Electroforesis en gel de agarosa 6) Observación en transiluminador UV
4 1-Extracción de ADN Existen distintos métodos para extracción de ADN. Técnica A: Enriquecimiento de bacteria en medio de cultivo Ansada Resuspender en 150µl de Triton X-100 en buffer TE Hervir a baño de agua a 100 C 15 minutos ADN listo para PCR Tomar 50 µl del sobrenadante y colocar en tubo nuevo Centrifugar a rpm 5 minutos
5 Técnica B: Kit comercial de extracción QIAamp
6 Componentes de la Master Mix H 2 O ultrapura Buffer Mg +2 dntps Primer forward Primer reverse ADN polimerasa Termociclador + ADN de interés
7 Preparación de Master mix Reactivos Solución stock Solución de trabajo Volumen en la mezcla (µl) Buffer 10 x 1x dntps 2,5 mm 0,1 mm MgCl2 25 mm 1,5 mm Iniciador a 100 pmol/µl 2 pmol/µl Iniciador b 100 pmol/µl 2 pmol/µl Taq pol 5 U/µl 0,02 U/µl ADN templado 2 H2O ultrapura Volumen final 50
8 Pasos durante la amplificación 1) Desnaturalización inicial 2) Ciclos:- Desnaturalización - Unión o annealing -Extensión 3) Extensión final C C C C C Importancia de los controles: Control Positivo: ADN diana que se sabe amplifica el gen buscado. Permite verificar que este correcto el procedimiento. Control Negativo: Componentes de Master mix sin ADN. Permite ver que no haya contaminación.
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10 Cuidados a tener en cuenta Trazas de ADN contaminante podrían servir como ADN molde, llevando a la amplificación de un fragmento incorrecto(falsos POSITIVOS). Para evitarlo es fundamental: Trabajar en condiciones de asepsia Lugar de trabajo bien limpio, trabajar con guardapolvo, guantes Material que se utiliza debe estar esterilizado Preferible si es material nuevo Evitar corrientes de aire Zonas de trabajo Recomendable: zonas de trabajo físicamente separadas y dotadas de material adecuado. Zona de preparación de la muestra: Extracción y purificación del material genético. Zona de PCR: preparación de master mix y muestras. Zona post-pcr: donde se realiza la amplificación de ADN.
11 Revelado Los fragmentos de PCR se revelan mediante electroforesis en gel de agarosa. Geldeagarosaybuffer decorridataeotbe Siembra 5 µl de muestra + 2 µl de azul de bromotimol Visualización
12 Conceptos básicos Especificidad: Generación de un único producto de amplificación. Eficiencia: Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos. Fidelidad: Número de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia (menor número de errores, mayor fidelidad). Sensibilidad: Mínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran cantidad de copias Aplicaciones En Microbiología: Identificación de microorganismos por presencia de una secuencia especifica del gen 16S ARNr u otros genes específicos de especie Selección de clones que posean genes asociados a virulencia, resistencia a antibióticos, etc. Establecer relación entre cepas durante brotes o estudio epidemiológicos En otras áreas: Identificación de genes para diagnostico y medicina legal Investigación de modelos de expresión
13 Ventajas A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable Rapidez en el diagnostico Mayor sensibilidad que los cultivos Se puede amplificar ADN de cualquier organismo, vivo o muerto El fragmento obtenido se puede clonar, secuenciar y analizar Desventajas Sepuedenreproducirpartesdelgenomacuyasecuenciaseconoceyconstade20a40pbdelongitud Se necesitan PRIMERS específicos La enzima ADN polimerasa puede tener errores al sintetizar Puede contaminarse con otro ADN Reactivos costosos
14 Tipos de PCR Nested PCR Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Ventajas: brinda alta sensibilidad y especificidad Desventajas: no permite cuantificar la muestra
15 PCR multiplex PCR en la cual se amplifica simultáneamente dos o más secuencias. Para lo cual se combinan dos o más pares de cebadores en el tubo de la mezcla junto con los demás reactivos.
16 RT- PCR Variante de PCR en donde una hebra de ARN mensajero es transcripta a ADN complementario (ADNc) usando la enzima retrotranscriptasa, y el resultado se amplifica como una PCR tradicional.
17 Aplicaciones en el laboratorio de Microbiología
18 Sensibilida d de la técnica nested- PCR para el gen yada Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidiode los productos de amplificación obtenidos por nested-pcr cuando distintas concentraciones de Y. enterocolitica W1024 fueron inoculadas en chorizo de puro cerdo. (a)adn extraidomediante el protocolo desarrollado por Kapperudy modificado en el presente trabajo, (b)adn extraído mediante el reactivo PrepManUltra. Línea M: marcador de peso molecular de 100pb; C (-): control negativo.
19 PCR múltiplex para la determinaci ón de la presencia de genes de virulencia Electroforesis en gel de agarosa para ver los fragmentos de PCR multiplex de Yersinia enterocoliticapara los genes Invy yst. 1: Cepa 51, B2/O:9:Inv: 558pb ; yst: 192pb 2: Cepa 52, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb 3: Cepa 53, B2/O:9:Inv: 558pb ; yst: 192pb 4: Cepa 64, B4/O:3:Inv: 558pb 5: Marcador de peso molecular 6: Cepa 68, B4/O:3:Inv: 558pb ; yst: 192pb 7: Cepa de referencia, W1024, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb 8: Cepa de referencia, MCH700, B4/O:3: Inv: 558pb ; yst: 192pb 9: Control negativo 10: Marcador de peso molecular
20 Resistencia a ATM de Helicobacterpylori El mecanismo de resistencia a Claesta asociado a mutaciones puntuales en la región peptidiltransferasa del gen 23s RNAr principalmente en las posiciones 2142 y 2143 en las cuales una guanina o citocina reemplazan una adenina. ACGGAAAGACC WT S CLA ACGGGAAGACC A2142G R CLA ACGGAGAGACC A2143G R CLA Amplificación fragmento 450 pb Corte con enzima BsaI Corte con enzima MboII
21 Bibliografía SommaM, QuerciM. Análisis de la presencia de los organismos genéticamente modificados en muestras de alimentos. Sesión N 6 Torres Tejeda AG, Baca BE. Reacción en cadena de la polimerasa. Centro de investigación microbiológica. Instituto de ciencia. Universidad de puebla.
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