PCR Múltiplex. Listeria monocytogenes
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- María Victoria Caballero Castro
- hace 7 años
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1 PCR Múltiplex Listeria monocytogenes
2 PCR-múltiplex En una sola reacción de PCR se amplifican al mismo tiempo 2 o más genes Condiciones similares de PCR para los genes amplificar: Desnaturalización Alineamiento Extensión Se emplean mas de 1 par de primers (fw y rv; 1 par por cada gen)
3 Primers para PCR múltiplex (características) Específicos para cada gen No hibridar en zonas donde no se requiere sobre todo en zonas del otro gen a amplificar No hibridar entre ellos
4 Internalina A
5 Internalinas
6 MÉTODO Nota: Utilizar guantes a lo largo de todo el protocolo.
7 PCR MASTER MIX Verifique que los tubos de reacción se encuentre perfectamente descongelados antes de su utilización
8 PCR MASTER MIX Mantenga los tubos que contienen la Taq Polimerasa recombinante Fermentas, el DNA templado, los primers y los dntp s a -20 C hasta el momento de uso
9 PCR MASTER MIX Centrifuga (PIN-PULSO CENTRÍFUGA) brevemente el contenido de los tubos antes de usar
10 En un microtubo de centrífuga de 1.5 a 2.0 ml preparar la siguiente mezcla de reacción Considerar que la siguiente proporción de reactivos considera solamente 1 reacción MÚLTIPLEX de amplificación.
11 PCR múltiplex MASTER MIX L. monocytogenes Master Mix VOLUMEN PARA UNA REACCIÓN Buffer (KCl) 5.0 µl MgCl 2 (2.5 mm) 5.0 µl dntp (0.2 µm) 1.0 µl inla Fw (1 µm) 2.9 µl inla Rv (1 µm) 2.4 µl inlc Fw (1 µm) 2.8 µl inlc Rv (1 µm) 2.8 µl Agua grado biología molecular µl Taq polimerasa (Fermentas ) 1.25 µl DNA Templado 1.0 µl Volumen total 50.0 µl Realizar los cálculos pertinentes para el número de muestras a amplificar además de 1 reacción de exceso por errores en pipeteo
12 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 1. Amortiguador-KCl 10X 10.0 µl Seleccionar volumen Tomar punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Al ser el primer reactivo y tener el tubo vacío colocarlo en el fondo del microtubo de 2.0 ml-master mix
13 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 2. Magnesio-MgCl 2 (2.5 mm) 10.0 µl Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo de 2.0 ml-master mix y oprimir a segundo tope
14 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 3. dntp s 2.0µL Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de eppendorf-master mix y oprimir a segundo tope
15 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 4. Primer Forward (inla Fw) 5.8 L Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope
16 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 5. Primer Reverse (inla R) 4.8 L Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope
17 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 6. Primer Forward (inlc F) 5.6 L Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope
18 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 7. Primer Reverse (inlc R) 5.6 L Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope
19 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) Realiza cálculos sumar volúmenes del resto de componentes y por diferencia con 100 µl determinar la cantidad de agua a adicionar 8. AGUA GRADO BIOL MOL 51.7 µl Seleccionar pipeta y volumen Tomar punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope
20 PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 9. Taq polimerasa recombinante (Fermentas) 2.5 µl Seleccionar pipeta y volumen Tomar punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope
21 1o.TRANSFERENCIA MASTER-MIX A TUBO PCR MASTER MIX 49 µl Seleccionar pipeta y volumen Tomar punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en la pared del microtubo para PCR y oprimir a segundo tope
22 PCR-MASTER MIX 11. DNA TEMPLADO 1.0 L Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Introducir punta DENTRO DE LA SOLUCIÓN CONTENIDA EN el microtubo de PCR y oprimir a segundo tope Tapar PERFECTAMENTE
23 PCR MASTER MIX 12. Mezclar el contenido, dando golpes suaves al fondo del microtubo de PCR ( con lo cual se mezcla toda la MASTER MIX-TEMPLADO)
24 TERMOCICLADOR 13. Introduce los tubos de PCR con la MASTER MIX-TEMPLADO al termociclador
25 14. Programación del termociclador BioRad MyCycler: 1 ciclo de desnaturalización: 95.0 C 5.0 min 30 ciclos de amplificación: desnaturalización 95.0 C 1.0 min Alineamiento 58.7 C 1.0 min amplificación 72.0 C 1.5 min 1 ciclo de amplificación final 72.0 C 5.0 min Refrigeración 4 C
26 FUNCIONAMIENTO/ PROGRAMACIÓN TERMOCICLADOR Se proporcionará la explicación por equipo
27 Tengo que venir a la 1 o 2 pm cuando acabe la amplificación? NO!! Los profesores se e encargarán de retirar el tubo de PCR con tu multiplex inla /inlc de Listeria monocytogenes amplificado del termociclador Se recomienda almacenar el producto de PCR a 20 ºC. (será realizado por los Profesores)
28 LA PRÓXIMA SESIÓN REALIZAREMOS LA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA A PARTIR DEL PRODUCTO MULTIPLEX inla/inlc DE PCR
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