Aplicación de técnicas moleculares para el estudio de la biodegradación de hidrocarburos

Transcripción

1 Aplicación de técnicas moleculares para el estudio de la biodegradación de hidrocarburos Presenta: M. en B. Olivia Tzintzun Camacho Laboratorio de Residuos Sólidos W-108 y W-103

2 INTRODUCCIÓN

3 Sitios contaminados por petróleo

4 Técnicas de remediación de suelos Técnicas tradicionales o establecidas Incineración Mezclar, enterrar y cubrir Dispersión sobre el terreno Solidificación Reuso y Reciclado -Bajo costo -Degradación del contaminante Técnicas innovadoras Extracción de vapores del suelo Aspersión de aire Desorción térmica Deshalogenación química Enjuague del suelo in situ Extracción con solvente Lavado del suelo Medidas Fitocorrectivas Biorremediación No perjudica las -No perjudica las propiedades del suelo 1 1. Rahman et al., 2002

5 Biorremediación Uso de consorcios microbianos para la remediación Consorcios

6 Biodegradación de hidrocarburos La degradación de hidrocarburos puede darse por: Cultivos puros Cultivos mixtos

7 Biodegradación de hidrocarburos La degradación de hidrocarburos puede darse por: Efectos sinérgicos entre las poblaciones (Mukred et al.,, 2008) Cultivos mixtos La cooperación entre las actividades metabólicas de las poblaciones (Wang et al.,, 2006)

8 Degradación por cultivos mixtos La capacidad de degradación de un consorcio microbiano depende Asociaciones poblacionales que se establecen Los mecanismos pueden ser complejos Capacidad metabólica de cada una de las cepas De dónde se Degradar compuestos Remover metabolitos obtienen los oxidados parcialmente producidos por otras microorganismos? poblaciones (Ghazali et al., 2004).

9 Aislamiento de microorganismos degradadores Pantano contaminado en Veracruz

10 Identificación de microorganismos degradadores Electroforesis en Gel con Gradiente de Desnaturalización (DGGE) Técnica de huella, rastreo o trazado molecular l (molecular l l fingerprinting )

11 Identificación de microorganismos degradadores Procedimiento para DGGE 1. Extracción de DNA Lisis celular (SDS) Digestión con (RNAasa) Precipitación de proteínas Lavado del DNA (etanol) Recuperación de DNA (isopropanol) Hid t ió Hidratación del DNA (Buffer TE)

12 Identificación de microorganismos degradadores Procedimiento para DGGE 2. Amplificación de la región variable V6-V8 del gen 16SrDNA por PCR

13 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Identificación de microorganismos degradadores DNA molde dntps MgCl 2 Taq polimerasa Primers Buffer

14 Identificación de microorganismos degradadores 3. Visualización de los productos de la región variable V6-V8 del gen 16SrDNA por PCR PCR región V6- V8 16SrDNA pb

15 Identificación de microorganismos degradadores 4. Preparación del gen de poliacrilamida y desarrollo del DGGE Agentes desnaturalizantes: urea y formamida 44% 54%

16 Identificación de microorganismos degradadores 4. Preparación del gen de poliacrilamida y desarrollo del DGGE Muyzer et al., 1996

17 Identificación de genes catabólicos gen alkb Pseudomonas oleovorans: Peters J, Witholt B. Biochim Biophys Acta (1994) 1196(2): β-oxidación (Whyte et al., 2002)

18 Identificación de genes catabólicos El plásmido OCT de Pseudomona oleovorans contiene dos operones alkbfghjkl y alkst. Qué se hace experimentalmente? (van Beilen et al., 1994)

19 Identificación de genes catabólicos Etapa C Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 94 C 1 min 1 Desnaturalización 94 C 1 min Alineamiento 50 C 1 min 30 Extensión 72 C 2 min Extensión final 72 C 10 min 1

20 Identificación de genes catabólicos

21 Identificación de genes catabólicos Secuenciación ió

22 Identificación de genes catabólicos Secuenciación ió

23 Identificación de genes catabólicos Secuenciación ió

24 Uso de herramientas moleculares para estudiar la biodegradación de hidrocarburos Identificar cepas bacterianas (DGGE) Dinámica de las poblaciones durante la degradación de hidrocarburos. Identificación de genes catabólicos (PCR) Expresión de los genes catabólicos (PCR-TR) Díaz-Ramírez et al., 2008

25 Uso de herramientas moleculares para estudiar la biodegradación de hidrocarburos Expresión de los genes catabólicos (PCR-TR) Powell et al., 2006

26 Grupo de trabajo del Laboratorio de Residuos Sólidos