Universidad Nacional Autónoma de México

Transcripción

1 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Curso Genética y Biología Molecular (1630) Licenciatura Químico Farmacéutico Biológico Dra. Herminia Loza Tavera Profesora Titular de Carrera Departamento de Bioquímica Lab 105, Edif E hlozat@unam.mx

2 IX. PRINCIPIOS DE INGENIERÍA GENÉTICA Objetivo general El alumno conocerá los principios de la tecnología del DNA recombinante y su potencial para generar organismos genéticamente modificados.

3 Objetivos particulares 1. Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos nucleicos 2. Generación de moléculas de DNA recombinante 3. Ingeniería Genética 4. Clonación y células troncales. El alumno Examinará los principios y las bases de algunas técnicas utilizadas en biotecnología (PCR, construcción y escrutinio de bibliotecas, Northern y Southern-blot, microarreglos) Distinguirá las diferencias entre biblioteca genómica y de cdna Comprenderá el principio de la técnica de la amplificación de ácidos nucleicos por PCR Conocerá los métodos de análisis para evaluar la expresión genética a nivel de RNA y proteínas Conocerá las características, funcionamiento e importancia de las enzimas de restricción Conocerá las características principales de los plásmidos como vectores de clonación Conocerá la existencia de vectores de clonación diferentes a los plásmidos (fagos, cósmidos, BACS y YACS) Describirá las técnicas y pasos para la clonación y expresión de moléculas recombinantes de DNA en organismos heterólogos Conocerá los métodos utilizados en la expresión de proteínas recombinantes en organismos heterólogos Conocerá la aplicación de los organismos transgénicos en la agricultura, farmacia y medicina Conocerá la aplicación de producción fármacos y vacunas en animales y plantas transgénicos Conocerá las estrategias generales de clonación de células de mamíferos Conocerá las características generales de las células troncales y las aplicaciones potenciales de éstas en la terapia. X X X X X X X X X X X X Conocimiento Comprensión Aplicación

4 INGENIERÍA GENÉTICA

5 Clonación molecular Clonar significa hacer copias idénticas Este término originalmente fue aplicado al procedimiento de aislar una célula y permitirle reproducirse creando una población de células idénticas Actualmente, la clonación molecular involucra la separación de un fragmento de DNA específico, unirlo a una pequeña molécula de DNA acarreador y luego replicar este DNA modificado miles o millones de veces mediante el incremento en el número de células así como por al aumento en el número de copias del DNA clonado en cada célula El resultado es una amplificación selectiva de un gen o segmento de DNA en particular

6 1 2 La clonación molecular involucra los siguientes pasos 4 3 in a selective medium 5 1. Aislamiento del DNA a clonar y purificación del vector molecular 2. Corte del DNA usando enzimas de restricción 3. Unión del DNA exógeno en el vector molecular 4. Introducción del DNA recombinante en un organismo para su amplificación 5. Selección de las células que contienen el DNA recombinante

7 AISLAMIENTO DE DNA Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (detergentes, proteasas, cambios de presión) Separación del DNA del resto de los componentes celulares (principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas, solventes (fenolcloroformo) Repetir la extracción. Eliminación del fenol Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol Disolver el DNA (se concentra) Análisis del DNA

8 Análisis de ácidos nucléicos por espectrofotometría Espectro de absorción de DNA Estimación de la concentración de A.N. por espectrofotometría A 260 = 1 50 g/ml DNA dc 33 g/ml DNA cs 40 g/ml RNA Determinar la relación A 260 / A 280 para saber que tan contaminado está con proteínas A 260 / A 280 => buena preparación. Determinar la relación A 260 / A 230 para saber que tan contaminado está con polisacáridos

9 Análisis electroforético de ácidos nucléicos Separación en geles de agarosa (1 4%) Electroforesis horizontal. Migran al ánodo Tinción con bromuro de etidio o Sybr safe Intercala entre las bases del DNA Forman complejos fluorescentes

10 Separación electroforética de moléculas de DNA + (A) Geles de secuenciación (separación de bandas con 1 nt de diferencia) (B) Electroforesis para RFLP (separación entre 100 a 10,000 nt) (C) Electroforesis de campo pulsante (separación de DNA cromosomal) + +

11 Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas de DNA y cortan en esos sitios Son purificadas de bacterias o producidas de manera recombinante Las enzimas de restricción son endonucleasas Rompen en sitios específicos del DNA Reconocen secuencias palindrómicas específicas de 4, 6, u 8 pb. Algunas generan extremos romos y otras generan extremos cohesivos, éstos pueden ser: - 5 protruyentes - 3 protruyentes

12 El corte del DNA con enzimas de restricción genera extremos romos 5 protruyentes 5 protruyentes Análisis 3 protruyentes

13 Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias, su función natural es proteger contra DNA extraño

14 Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos (sticky) que pueden asociarse con otros semejantes DNA de un plásmido digerido con EcoRI DNA genómico digerido con EcoRI Extremos son compatibles Las bases de los extremos cohesivos se aparean, aunque quedan sin unir covalentemente

15 Vectores de clonación Plásmidos DNA doble cadena, circular, origen propio de replicación Se pueden clonar fragmentos entre 1,000 y 10,000 nucleótidos

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17 Origen de replicación Permite que la molécula se replique en un cierto tipo de célula Características de los plásmidos Marcadores de resistencia a antibióticos Permiten la selección de bacterias transformadas con el plásmido o con el DNA recombinante

18 Características de los plásmidos Sitio múltiple de clonación: Sitios reconocidos por diferentes enzimas de restricción que solo cortan una vez en el plásmido

19 Operon Lac : regulación de la expresión de lacz Off On Inductor Jacob Monod

20 Resultado de hidrolizar el X-gal Cuando se cultivan colonias silvestres (wild type) en presencia de X-gal y se induce la expresión de -galactosidasa con un inductor gratuito, el X-gal es cortado produciendo un pigmento azul y por lo tanto las colonias son azules. -gal color azul IPTG: Inductor gratuito LB-agar IPTG + X-gal

21 a-complementación El gen lacz tiene dos mutantes: DM15 y péptido a que no son capaces de producir -galactosidasa activa Sin embargo, cuando estos dos genes mutados se encuentran en una misma célula, el a péptido se combina con la proteína -gal mutante generando una enzima -gal activa la cual rompe al X-gal, produciendo colonias azules. Fenotipos de los mutantes lacz en X-gal

22 Aplicación de la a-complementación para la selección de moléculas recombinantes El MCS del vector está insertado entre el promotor y el péptido a, en el extremo 5 del gen lacz de E. coli Cuando el vector contiene un fragmento de DNA insertado en el MCS, la -galactosidasa no es activa y por lo tanto el X-gal no es roto y no se producen colonias azules, las colonias son blancas.

23 LB-Amp+ IPTG+X-Gal

24 Inserción de DNA exógeno en un vector molecular a) Corte del DNA con enzimas de restricción b) Ligación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector

25 Construcción de una molécula de DNA recombinante DNA A DNA B DNA AB ligasa Une covalentemente formando un enlace fosfodiéster

26 Reacción de ligación

27 Introducción de moléculas de DNA recombinante a bacterias hospederas Múltiples copias de DNA recombinante

28 Plásmido de bajo número de copias Plásmido de alto número de copias La transformación implica la introducción de DNA extraño a una célula hospedante

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30 Los fagos como vectores de clonación

31 Cromosomas artificiales de bacteria (BAC s) Gen de -galactosidasa Se pueden clonar hasta 350,000 nt Medio con sustrato de -gal Colonias azules: plásmido nativo Colonias blancas: plásmido recombinante

32 Cromosomas artificiales de levadura (YAC s) Se pueden clonar hasta 1,000,000 nucleótidos

33 Bibliotecas genómicas DNA genómico Digestión con enzima de restricción

34 Bibliotecas de cdna RNA mensajero Cebador de oligo dt Transcripción reversa Síntesis de DNA doble cadena

35 Bibliotecas genómicas vs Bibliotecas de cdna

36 BUSCANDO UN GEN EN UNA BIBLIOTECA GENÓMICA

37 Hibridación y reconocimiento de secuencias con alta homología ó a 65 o C ó a 50 o C

38 Marcaje de un fragmento de DNA (obtención de una sonda) Random primer Radioactivo: dctp No radioactivo: Fluoróforos Biotina a dctp[a 32 P]

39 BUSCANDO UN GEN EN UNA BIBLIOTECA GENÓMICA

40 SECUENCIACIÓN DE DNA

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43 Secuenciación de DNA por el método de Sanger No acepta elongación de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa dsdna molde ( secuencia?) 4 desoxiribonucleótidos (dntps) cebador de DNA DNA polimerasa

44 SECUENCIACIÓN DE DNA

45 La lectura de la secuencia se hace de abajo hacia arriba

46 Secuenciación automatizada de DNA En una sola reacción se incluyen los cuatro dideoxys marcados con un fluoróforo distinto cada uno. No es necesario detener la reacción. Es posible secuencias fragmentos 800 pb Se lee con un láser y se almacena la secuencia en una computadora.

47 DETECCIÓN DE UN GEN ESPECÍFICO

48 Pasos para la detección de genes específicos A nivel de genoma (DNA) Southern Blot A nivel de transcriptoma (RNA) Northern Blot 1. Aislamiento de DNA 2. Cortar con enzimas de restricción 3. Separar fragmentos por electroforesis 4. Desnaturalizar el DNA 5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 6. Hibridar con sonda específica 7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager 1. Aislamiento de RNA 2. Desnaturalizar el RNA 3. Separar por electroforesis desnaturalizante 4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 5. Hibridar con sonda específica 6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager

49 Bromuro de etidio Sonda 32 P

50 Southern Blot Northern Blot 28S 18S

51 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 95 C C 72 C

52 La amplificación es exponencial En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de interés

53 El uso de una DNA pol termoresistente ha permitido el desarrollo de la PCR Thermus aquaticus Taq DNA Polimerasa Great Fountain Geyser, Yellowstone. Manantial Temperatura C

54 Después del PCR los fragmentos se pueden clonar Los cebadores son diseñados con extremos reconocidos por enzimas de restricción

55 El PCR se puede utilizar como alternativa al Southern y Northern blot DNA: PCR Amplificación directa Exones + intrones RNA: RT-PCR 1. Transcripción reversa (obtención de cdna) 2. Amplificación por PCR Solo exones

56 Pruebas de identidad

57 La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones Detección de alelos mutantes caracterizados. Búsqueda de alelos mutantes no conocidos. Identificación de microorganismos patógenos. Caracterización de cepas del virus de la influenza Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cdna (Clonación de genes) Secuenciación de DNA Generación de mutantes puntuales. Estudiar la expresión génica.