ELECTROFORESIS. Agarosa. Poliacrilamida

Transcripción

1 ELECTROFORESIS DE ADN

2 ELECTROFORESIS Agarosa Poliacrilamida

3 Finalidad de la electroforesis Separar Identificar Purificar

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6 Tinción del ADN Bromuro de etidio Absorbancia a 302 y 366 y emisión a 590 nm. Detecta hasta 10 ng de ADN. Sybr-Green Sybr-Gold (x1000)

7 Migración Tamaño del ADN Concentración de agarosa Tipo de agarosa Conformación del ADN Voltaje Presencia de bromuro de etidio Tampón de electroforesis

8 Concentración de agarosa 0.3% 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0% Tamaño de los fragmentos de ADN separados 5-60 kpb 1-30 kpb kpb kpb kpb kpb kpb

9 Migración Tamaño del ADN Concentración de agarosa Tipo de agarosa Conformación del ADN Voltaje Presencia de bromuro de etidio Tampón de electroforesis

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11 Migración Tamaño del ADN Concentración de agarosa Tipo de agarosa Conformación del ADN Voltaje Presencia de bromuro de etidio Tampón de electroforesis

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13 Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis) _ + _ + - Dos campos eléctricos alternantes con diferente orientación - Separación desde 10 kpb hasta unas 10 Mpb, en función del tiempo de pulsos: seg: 0,2 2,2 Mpb (S. cerevisiae), 5-20 min: 1 3 Mpb (Candida albicans) min: 3 6 Mpb (S. pombe, A. nidulans) min: 5 11 Mpb (P. chrysogenum, N. crassa) A pulse CHEF B pulse OFAGE (Orthogonal Field Alternation Gel Electrophoresis. - TAFE (Transverse Alternating Field Electrophoresis). - FIGE (Field Inversion Gel Electrophoresis). - RFE (Rotating Field Electrophoresis). - CHEF (Contour-Clamped Homogeneous Electric Field)

14 Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis) Marker ATCC FGSC4 OR31 R153 Marker ATCC FGSC4 OR31 R153 Marker ATCC FGSC4 OR31 R VIII VII II I-V III VI III III-VI IV pen argb

15 Electroforesis de ADN en gel de poliacrilamida - Permiten una resolución mucho mejor, hasta con un solo nucleótido de diferencia. Separa fragmentos de hasta kpb) - Usos: geles de secuencia, primer extensión, AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSRs (Simple Sequence Repeats)

16 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: SOUTHERN BLOT

17 HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS APAREAMIENTO COMPLEMENTARIO DE BASES ENTRE DOS ACIDOS NUCLEICOS DE HEBRA SIMPLE PRODUCTO DE HEBRA DOBLE. DNA/DNA RNA/RNA DNA/RNA

18 HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS Cómo se mantienen unidas las dos hebras? Puentes de hidrógeno entre las bases. Interacciones hidrofóbicas entre las bases adyacentes de una misma hebra.

19 FACTORES QUE AFECTAN A LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACIÓN ENTRE ÁCIDOS NUCLEICOS Temperatura Número de pares CG y de pares AT Grado de complementareidad Longitud de las cadenas Concentración de sales en la solución Concentración de formamida en la solución

20 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Número de pares GC v/s pares AT Mayor número de enlaces de H entre la hebras mayor estabilidad de los híbridos. 3 enlaces de H entre G y C 2 enlaces de H entre A y T

21 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Grado de complementariedad Menor complementariedad de bases, menos enlaces de H formados menor estabilidad

22 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Longitud de las hebras Mayor longitud de las hebras (cdnas) > 200 pb más enlaces de H mayor estabilidad del híbrido. Menor longitud de las hebras (oligos) < 50 pb Mayor especificidad Menor probabilidad de hibridación cruzada

23 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Concentración de sales en la solución [sal] estabilidad del híbrido Cationes monovalentes (Na + ) o divalentes (Mg ++ ) Las cargas negativas de los grupos fosfato se repelen unas a otras. Los iones positivos en solución reducen la repulsión electrostática entre las hebras.

24 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Temperatura Mayor T aumenta la energía cinética de las hebras y desestabiliza la estructura de los ácidos nucléicos. las hebras se separan.

25 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS ph [OH - ] ionización de los grupos fosfato, favoreciéndose la repulsión electrostática entre las hebras. Concentración de formamida Probablemente forma enlaces de H con los ácidos nucléicos. Desestabiliza la formación de híbridos

26 El efecto combinado de estos factores puede ser expresado en una ecuación para el calculo de la Tm Qué es la Tm? Tm = temperatura de melting o de separación de las hebras. La Tm es una medida de la estabilidad de los híbridos definida como la temperatura a la cual 50% de los híbridos se encuentran formados y 50% permanecen disociados. 50% %

27 El efecto combinado de estos factores puede ser expresado en una ecuación para el calculo de la Tm Para DNA:DNA Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L) Para DNA:RNA Tm = 79,8 ºC + 18,5log[Na] + 58,4(%G+C) + 11,8(%G+C) 2-0,5(%formamida) - (820/L) Para oligonucleotidos en 1 M Na+ Tm ( o C) = 4 (G+C) + 2 (A+T)

28 Esquema Transferencia: capilaridad, vacío Fijación Hiridación Lavados Exposición: film de autoradiografía o Phosphorimager

29 Proceso de hibridación - Electroforesis en gel de agarosa - Desnaturalización (NaOH 0.4 N), neutralización - Transferencia e inmovilización: membranas de nylon con luz UV, de nitrocelulosa en un horno de vacío y con calor - Prehibridación: evitar que la sonda marcada se pegue a la superficie de la membrana donde no hay ADN. Buffer: SSC 6x; 0,1% SDS (p/v); formamida 40% (v/v); Denhardt 1x (Seroalbúmina bovina 2%, Ficoll 2%, Polivinilpirrolidona 2%); ADN de esperma de salmón desnaturalizado en una concentración final de 500 g/ml - Hibridación: mismo buffer con 100 g/ml de ADN de esperma de salmón + la sonda (de ADN: 200 pb 20 kpb. Oligonucleótido: pb) - Lavados: Eliminan la sonda que no ha hibridado. SSC 2x ó 0,1x; SDS. - Exposición Factores que afectan el proceso de hibridación: - Número de pares GC v/s pares AT - Grado de complementariedad - Longitud de las hebras - Concentración de sal en la solución: Na + o Mg 2+ - Temperatura - Concentración de formamida

30 Marcaje de la sonda - Marcaje por nick translation 32 P-dCTP Digoxigenina - Marcaje terminal 32 P-ATP, Polinucleótido kinasa P-TGTAAGNNN. - Rellenado de extremos 32 P-dCTP Klenow NNNGTAAG NNNCATTCCTAG - Random priming ADN desnaturalizado, primers de 6 pb, Klenow - Transcripción Sonda de ARN a partir de un molde de ADN. ARN polimerasa T4, T7 o SP6

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32 Marcaje con digoxigenina BCIP: 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato NPT: Nitroblue tetrazolium salt 1,2-dioxietano sustrato: AMPPD

33 Reutilización de filtros: La sonda puede ser eliminada tras la hibridación y reutilizarse el filtro. Lavado con NaOH 0,25 N, 2% SDS, o con formamida a temperatura elevada. - Estas técnicas de marcaje e hibridación para Southern blot son válidas esencialmente, con algunas modificaciones, para otras técnicas de hibridación: Northern, hibridación de colonias de E. coli, rastreo de bibliotecas en fagos, etc.

34 - Para una genoteca de cdna (genoteca de expresión) - Rastreo con un anticuerpo. Cuando se ha purificado la proteína y se han obtenido anticuerpos, o bien si están disponibles anticuerpos contra la proteína homóloga de otro organismo. - Rastreo a través de la actividad enzimática de la proteína. Cuando existe un método de detección de dicha actividad que pueda analizarse en placa.

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36 Sistemas Two-Hybrids 1. Ligar el inserto de ADN que codifica para la proteína cebo en el vector pbd-gal4 Cam 2. Ligar el inserto de ADN que codifica para la proteína (o proteínas) blanco en el vector pad-gal Coexpresar las proteínas cebo y blanco en levaduras 4. Ensayar la activación transcripcional del gen reportero 5. Verificar la interacción a través de un ensayo de comprobación

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