CURSO DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA

Transcripción

1 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Odontología Laboratorio de Genética Molecular CURSO DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA Diapositivas 4 Dra. Laurie Ann Ximénez-Fyvie Mtra. Adriana Patricia Rodríguez Hernández

2 Métodos para el estudio de microorganismos Técnicas microscópicas Campo claro Campo obscuro Contraste de fases I.D. de Nomarski Fluorescencia Confocal Electrónica de barrido Estereoscópica (magnificación) Métodos para el cultivo bacteriano Medios de cultivo Técnicas de sembrado Aislamiento de cepas Pruebas de susceptibilidad Conc. mínimas inhibitorias (MIC) Conc. mínimas bactericidas (MBC) Antibiogramas (Kirby-Bauer) Identificación fenotípica Tinción de Gram Morfología celular Motilidad Tolerancia al oxígeno Morfología de colonia Tipificación bioquímica Perfiles de proteínas celulares Identificación genética Hibridaciones DNA-DNA PCR Secuenciación 16S rrna

3 Métodos para el estudio de microorganismos Identificación fenotípica Tinción de Gram Morfología celular Motilidad Tolerancia al oxígeno Morfología de colonia Tipificación bioquímica Perfiles de proteínas celulares

4 Identificación fenotípica Definición Aplicación Ventajas Desventajas Secuencia consecutiva de métodos de microbiología tradicional que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados. Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros. Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o en paralelo a la identificación. Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas. En comparación a la identificación genética: Más laborioso. Mayor tiempo y costo. Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas. Subestimación de especies fastidiosas. No permite la identificación de especies no-cultivables.

5 Identificación fenotípica- Diagrama de flujo Tinción de Gram Morfología celular Motilidad Tolerancia al O 2 Morfología de colonia Tipificación bioquímica Perfiles de proteínas celulares

6 Identificación fenotípica- Tinción de Gram Gram positivo Gram negativo

7 Identificación fenotípica- Morfología celular Coco Bacilo Espirilo Pleomórfico

8 Identificación fenotípica- Motilidad Contraste de Fases Campo Obscuro En Agar Sin motilidad De nado (Swimming) De deslizamiento (Glidding) En espasmos (Twitching) Tubo de Punción

9 Identificación fenotípica- Tolerancia al oxígeno Anaerobio estricto (en ausencia de O 2 ) Microaerofílico (en conc. bajas de O 2 ) Capnofílico (en presencia de CO 2 ) Anaerobio facultativo (en presencia/ausencia de O 2 ) Aerobio estricto (en presencia de O 2 )

10 Identificación fenotípica- Morfología de colonia Color Tamaño Forma Textura Consistencia Periferia Adherencia al agar Formación de fosas Propiedades hemolíticas Fluorescencia con luz UV

11 Identificación fenotípica- Tipificación bioquímica Fermentación de carbohidratos Productos terminales Catalasa Oxidasa Coagulasa Reacciones de aglutinación

12 Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)

13 Métodos para el estudio de microorganismos Identificación genética Hibridaciones DNA-DNA PCR Secuenciación 16S rrna

14 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete). Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros. En comparación al resto de las pruebas de identificación: Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras. En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo. Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas. Permite la identificación de especies no-cultivables. En comparación a otras pruebas genéticas: Es posible cuantificación las especies evaluadas. En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación. En comparación a otras pruebas genéticas: Menor sensibilidad y especificidad.

15 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadora que permite su detección después de la hibridación Molécula Reportadora Radioactiva: Isótopos con emisiones β (generalmente P 32 ) No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc. Especificidad: determinada por el diseño de la sonda Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda Southern Blot Blanco = DNA Sonda = DNA Northern Blot Blanco = RNA Sonda = DNA Western Blot Blanco = Proteína Sonda = Anticuerpo

16 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA MiniSlot MiniBlotter Canales abiertos Membrana de nylon Canales de hibridación Membrana de nylon Filtros Socransky et al. Biotechniques 1994

17 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Socransky et al. Biotechniques 1994

18 Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA * Serotipos a: & b: Subespecies nucleatum: 25586, polymorphum: & vincentii: 49256

19 Métodos genéticos- PCR Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete). Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros. En comparación al resto de las pruebas de identificación: Mayor sensibilidad. En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo. Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas. Permite la identificación de especies no-cultivables. En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación. En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA: No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real). En comparación a hibridaciones DNA-DNA: Bajo número de especies evaluadas.

20 Métodos genéticos- PCR Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers y extensión para producir múltiples copias de una secuencia determinada de DNA Especificidad: determinada por el diseño de los primers Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula PCR

21 Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rrna Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rrna en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas. Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos puros. En comparación al resto de las pruebas de identificación: Mayor especificidad. En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo. Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas. Permite la identificación de especies no-cultivables. En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación. En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA: No permite la cuantificación de especies. En comparación a hibridaciones DNA-DNA: Bajo número de especies evaluadas.

22 Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rrna Comparación con bancos de secuencias conocidas Especificidad: hipotéticamente absoluta Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula Secuenciación 16S rrna