MATERIALES Y MÉTODOS

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1 MATERIALES Y MÉTODOS Para la obtención, aislamiento y caracterización de la proteína de superficie HSPB66 de H. pylori ATCC se realizó un cultivo de esta cepa, seguido de la extracción de proteínas de superficie, las cuales fueron purificadas y caracterizadas. Las técnicas empleadas se describen brevemente a continuación. Cultivo de Helicobacter pylori ATCC Para llevar a cabo el cultivo de la cepa Helicobacter pylori ATCC 43504, en primera instancia se efectuó la reactivación de la cepa, utilizando como medio de cultivo caldo BHI a 37 C por un período de tres a cinco días consecutivos en una jarra de anaerobiosis para mantener las condiciones de microaerofilia (5% O 2, 5-10% CO 2 ). Posteriormente, se realizó un cultivo de la cepa en el medio GAB-CAMP suplementado con 8.5% de sangre humana lisada, 10% de suero inactivado de caballo y 0.05% de hidrocloruro de cisteína, vancomicina, ácido nalidíxico y ketoconazol. Para la obtención de mayor biomasa se realizaron cultivos en caldo y agar Brucella con 10% de suero de caballo y suplemento antimicrobiano. El tiempo de cultivo para 300 ml de caldo Brucella fue de 10 días, de acuerdo a lo previamente reportado para las condiciones de crecimiento de este microorganismo (Ansorg y col., 1991). Asimismo, se llevó a cabo un control de calidad de la cepa H. pylori ATCC mediante su caracterización bioquímica, observándose la producción de ureasa, catalasa y oxidasa y manifestando β-hemólisis en agar sangre. También se verificó su morfología mediante tinción gram, siendo un bacilo gram negativo. De este modo, se comprobó la pureza de todos los cultivos realizados al coincidir las características bioquímicas y morfologías con lo reportado en la literatura (Ansorg y col., 1991). La confirmación de la viabilidad y pureza celular de los cultivos es una paso indispensable para la adecuada ejecución de cualquier trabajo en el área de microbiología, así como la determinación o confirmación de las condiciones óptimas para el adecuado desarrollo bacteriano, evitando 17

2 que el microorganismo pudiese modificar su comportamiento bioquímico, debido a condiciones de estrés, que afectarán la producción de proteínas (Allen y col., 2004). Las colonias de H. pylori obtenidas se resembraron en caldo Brucella con 10% de suero de caballo y suplemento antimicrobiano y se incubaron en ambiente microaerofílico a 37 o C por tres días. Posteriormente se cosecharon y conservaron a -20 o C para el aislamiento proteico (Ruiz-Bustos y col., 2001). Extracción de Proteínas de Superficie Para la obtención de un pellet bacteriano que contenga proteínas de superficie de la cepa Helicobacter pylori ATCC 43504, se recolectaron células de los medios de cultivo Brucella mediante centrifugación a 3000 g por 15 min. El sedimento obtenido se suspendió en agua destilada y se centrifugó nuevamente a 3000 g por 15 min para eliminar residuos pertenecientes al medio de cultivo. Posteriormente, se adicionaron 10 ml de urea 3 M por cada gramo de pellet bacteriano obtenido con la finalidad de separar las proteínas de superficie de la membrana celular. El exceso de urea 3 M fue eliminado paulatinamente mediante diálisis contra NH 4 HCO M durante un período de 14 días consecutivos, realizando cambios de la diálisis cada 8 h. Como resultado de la extracción proteica, se registró la cantidad en peso de las proteínas de superficie de H. pylori ATCC para estimaciones de la obtención promedio de HSBP a partir de un cultivo de 300 ml de caldo Brucella. Purificación y Caracterización Parcial de la Proteína HSBP66 de Superficie Cromatografía de afinidad Las fracciones proteicas obtenidas a partir de los sobrenadantes de los cultivos líquidos, se sometieron a un procedimiento cromatográfico de afinidad a heparina. Se diluyeron las 18

3 muestras 1:1 en acetato sódico 0.1 M (ph 5.0) y filtraron a través de membranas de 0.45 µm. Se aplicaron muestras de 1 ml a una columna Hi-Trap de heparina de 5 ml previamente equilibrada con acetato sódico 0.1 M (ph 5.0) a un flujo de 1mL/min. Las proteínas adsorbidas fueron eluídas con cloruro de sodio 2 M bajo el mismo flujo, para recolectarse fracciones de 1 ml. Finalmente se lavó la columna con hidróxido de sodio 0.01 M y se regeneró con agua destilada y acetato de sodio 0.1 M. Las fracciones recolectadas fueron extensivamente dializadas contra bicarbonato de amonio 0.1 M y almacenadas a -20 C hasta su uso (Ruiz-Bustos y col., 2001). Con la finalidad de eliminar el exceso de NaCl 2 M utilizado para la elución de HSBP de H. pylori ATCC 43504, se llevó a cabo una diálisis de las HSBP contra NH 4 HCO M por un período de 16 días consecutivos, realizando cambios cada 8 h. Posteriormente, para obtener un concentrado de HSBP se utilizó el liofilizador Labconco Freeze Dry System, programando las condiciones de vacío a 280 mbar a una temperatura constante de -50 C por un período de tiempo de 24 h. Cuantificación de HSBP por el método de Bradford Después de la obtención del liofilizado, se procedió a la cuantificación proteica por el método de Bradford, utilizando un estándar de BSA a una concentración de 1.42 mg/ml. Se realizaron lecturas a λ=570 nm de las muestras proteicas diluidas 1:2 en PBS 1x y se calculó la concentración de cada una de las muestras HSBP. Las concentraciones proteicas de las distintas muestras HSBP procesadas son indicadas en la sección de anexos. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Las HSBP totales de la cepa H. pylori ATCC purificadas por cromatografía fueron analizadas en su patrón de migración electroforético de acuerdo al método de Laemmli, utilizando el sistema Mini-Protean II de Bio-Rad. Las muestras proteicas fueron desnaturalizadas en proporción 5:1 con BM6x IgA (Tris-HCl 0.6 M, ph 6.8, 10% glicerol, 19

4 10% SDS, 5% β-mercaptoetanol y 0.05% azul de bromofenol) en oscilación constante por 1 min, cargando una concentración mínima de 55 µg por carril. La electroforesis SDS- PAGE se llevó a cabo en un gel de poliacrilamida al 15% a 80 volts por un período de 2 h y posteriormente el gel fue teñido con azul de Coomasie R-250. Ensayo de manchas de HSBP de Helicobacter pylori ATCC Se realizaron ensayos de manchas para determinar las diluciones óptimas de anticuerpos murinos para un posterior Western blot. Se emplearon concentraciones de HSBP de 1 µg/µl y se usó como anticuerpo primario el tercer sangrado de la inmunización murina de la cepa CD1 anti-hsbp de H. pylori ATCC Para el control negativo, se utilizó el suero de la preinmunización murina cepa CD1. El anticuerpo primario y el control negativo empleados en los ensayos de manchas fueron proporcionados por Campa-Viramontes y Rodríguez-Romero (2010). Como anticuerpo secundario, se emplearon diluciones a partir de una solución patrón 1:100 de anti-igg de cabra anti-ratón peroxidado. Los ensayos de manchas fueron revelados por la técnica de quimioluminiscencia, siendo el tiempo de revelado de 30 s, utilizando una mezcla de 1 ml de luminol con peróxido de hidrógeno en proporción 1:1. Transferencia electroforética de HSBP de Helicobacter pylori ATCC Para efectuar el ensayo de Western blot, se transfirieron muestras HSBP en una concentración mínima de 200 µg de geles de poliacrilamida al 15% SDS-PAGE a membranas de nitrocelulosa teñidas con rojo de Ponceau. Se empleó para ello el método semi-seco utilizando el equipo HEP-1 semi-dry-blotter 20 x 20 cm. Las condiciones óptimas determinadas para la transferencia de las HSBP totales a la membrana de nitrocelulosa fueron de 120 ma, amperaje constante, por un período de 45 min. 20

5 Western blot de HSBP de Helicobacter pylori ATCC Para la inmunodetección de HSBP totales, las proteínas transferidas a la membrana de nitrocelulosa fueron bloqueadas con 0.1% BSA y 5% de leche descremada en PBS IX por 1 h y lavadas con PBS IX. Posteriormente, la membrana se incubó con una dilución 1:4000 de suero murino anti-hsbp cepa CD1 por 2 h y se lavó 5 veces con PBS 1X-Tween % (PBS-T) por 5 min. Se empleó suero de preinmunización murina anti-hsbp cepa CD1 como control negativo. Después de la incubación con el anticuerpo primario, se añadió una dilución 1: de anti-igg de cabra anti-ratón peroxidado. La incubación con el anticuerpo secundario fue de 2 h y se lavó la membrana 5 veces con PBS-T por 5 min. Por último, se reveló la inmunodetección mediante quimioluminiscencia con 1 ml de H 2 O 2 y luminol en proporción 1:1. Determinación del punto isoeléctrico Las muestras de proteína se ajustaron a una concentración de 5-10 µg/ml en el buffer de muestra (urea 9.5M, tritón X-100 2%, anfolina %, ditiotreitol 50mM) antes del punto isoeléctrico (PI). Se preparó el gel con 5% de acrilamida y un rango de ph de 3-10 y se colocó en una cámara electroforética horizontal. Se cargaron las muestras y estándares del PI en el gel para correrse a 500V y 250 ma por 3h. Posteriormente se tiñó el gel con Azul Coomasie R-250 y las mediciones se calcularon de una curva estándar de acuerdo con la distancia de migración de los estándares del pi. Se corrió un segundo gel para punto isoeléctrico y se transfirió a membranas de Immobilon (Millipore) las cuales se revelaron por quimioluminiscencia. Identificación de la proteína purificada Una vez confirmada la masa molecular y el pi de la muestra proteica, se procedió a realizar una electroforesis SDS-PAGE con gel al 15% de acrilamida. La corrida electroforética se 21

6 efectuó a 80 volts por 2 h. Para efectuar la digestión con tripsina, se escindió la banda correspondiente a 66.2 kda con bisturí. El gel escindido se decoloró y se procesó según el método descrito para la digestión con tripsina en gel (Schevchenko y col., 2006). Posteriormente, los péptidos digeridos fueron almacenados a -70 C para enviarse a secuenciar por espectrometría de masas-masas (LC-MS/MS) en el laboratorio de Proteómica del Instituto BIO5 en la Universidad de Arizona (Tuscon, AZ, EUA). Identificación y comparación del gen hsbp66 de H. pylori ATCC Identificación del gen hsbp66 Se reunió la información concerniente a la masa molecular y pi de la proteína purificada y la secuencia de aminoácidos de los péptidos obtenidos mediante LC-MS/MS. Dicha información se comparó con los bancos de datos de dos secuencias completas del genoma de H. pylori reportadas en el GenBank, para identificar posibles genes que codifiquen para la HSBP66. Comparación del gen hsbp66 Se llevó a cabo un análisis in silico del gen hsbp66 empleando el paquete FastPCR versión , incluyendo los genomas de diez cepas de H. pylori reportadas en GenBank: 26695, J99, B8, B38, G27, HPAG1, P12, PeCan4, Shi470, y SJM180. Utilizando el mismo programa, se diseñaron cebadores para la amplificación del gen, proponiendo de esta forma los que cumplen con un reconocimiento de todas las cepas, además de que contengan una temperatura de hibridación (Tm) adecuada, y que generaran un tamaño adecuado del producto de PCR predecido. 22