INFORME PROYECTO DE INVESTIGACION

Transcripción

1 INFORME PROYECTO DE INVESTIGACION EFECTO DE LOS EXTRACTOS DIALIZABLES EN LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL EN UN MODELO DE INFECCIÓN IN VIVO CON HERPES SIMPLEXI CLAVE: DR. SERGIO ANTONIO ESTRADA PARRA. 1

2 INTRODUCCION Los factores de transferencia (TFs) son sustancias inmunomoduladoras capaces de transferir la habilidad de activar la respuesta inmune celular en receptores no inmunizados a partir de su obtención de células de donadores sensibilizados (Kirkpatrick y col., 1995). Los primeros estudios en los cuales se observó la activación de la inmunidad celular tras realizar la transferencia de algunos componentes sanguíneos fueron realizados por Landsteiner y Chase en los años 40 s, pero fue hasta los años 50 s que Lawrence denominó factores de transferencia a los componentes activos capaces de estimular de manera favorable a las células del receptor. A partir de estos experimentos, se definió la actividad de los TFs como antígenoespecífica, es decir, que la reacción inmunológica que se desencadena en el receptor es específica contra el antígeno empleado para inmunizar al donador del cual se obtienen los TFs (Lawrence, 1974). Los TFs son moléculas obtenidas al realizar un extracto dializable de leucocitos (DLEs, dialyzable leucocytes extracts) obtenidos de donadores inmunizados, cuya naturaleza química no ha sido del todo definida. Muchos modelos de estudio de los TFs han propuesto que su estructura química corresponde a la de un nucleopéptido, cuya especificidad se encuentra codificada en la porción peptídica. El peso aproximado de los TFs se estima entre 3.5 y 6 kda. Se han encontrado aplicaciones clínicas de los TFs ya que, al activar los mecanismos de inmunidad en el receptor, le proveen efectos profilácticos y terapéuticos, muy importantes en pacientes con deficiencias inmunitarias que les hacen susceptibles a infecciones oportunistas. De hecho, se ha demostrado que los TFs son eficientes en el control de enfermedades donde la respuesta celular es el mecanismo de defensa primordial, como en infecciones virales (herpes labial, varicela), infecciones por bacterias intracelulares (tuberculosis, lepra) e infecciones parasitarias (leshmaniasis, toxoplasmosis) (EstradaParra y col., 1998). Muchos grupos de investigación han informado efectos benéficos en pacientes con infecciones recurrentes con Herpes simplex (EstradaParra y col., 1995; Rozzo y Kirkpatrick, 1992) mostrándose en algunos casos la remisión total de las lesiones o una disminución considerable en la frecuencia y severidad de las manifestaciones clínicas. Hasta el día de hoy, no se han reportado efectos adversos después de la administración de los TFs. Estudios 2

3 comparativos entre diferentes rutas de administración demuestran que los efectos de los TFs son los mismos independientemente de la vía utilizada. A pesar de todo ello, es poco entendido los mecanismos moleculares y celulares por los cuales los TFs inducen protección. Existe la noción de que la repuesta inmune celular es uno de los principales mecanismos inmunológicos por los cuales se induce protección. Sin embargo, se desconoce el efecto que tenga sobre la respuesta inmune humoral. Es ampliamente conocido que este tipo de respuesta es fundamental para el control de diversos procesos infecciosos tanto virales como bacterianos. Es por ello que en el presente trabajo se evaluó el efecto de los EDL en la respuesta inmune humoral en un modelo de infección con Herpes simplex tipo 1. 3

4 MATERIALES Y METODOS Cultivo HSV1 En este trabajo se utilizó la cepa de Herpes simplex tipo 1 (HSV1) MacIntyre. Durante la propagación del virus HSV1 se utilizó a la línea celular Vero, la cual es derivada de células epiteliales derivadas de riñón de monos verdes. A una monocapa de células que recubrían una superficie de 75 cm 2, se le adicionó una solución que contenía el HSV1 en una relación de 1 virus por cada 10 células Vero. El virus es adsorbido por una hora y se agregó medio de mantenimiento e incubaron las células en un ambiente húmedo a 37 o C hasta que se observó el desarrollo de efecto citopático en el 8090% de la monocapa celular. Las células fueron lisadas con varios ciclos de congelación y descongelación y los restos celulares fueron descartados por centrifugación. Los abastos virales fueron alicuoteados y congelados a 70 C hasta su uso. Titulación del abasto viral La titulación del abasto viral se llevó a cabo por el método de dosis infectivas para el cultivo al 50% o DICT 50. Para la titulación del abasto viral se dispersaron células Vero con una solución de tripsina al 0.025% en verseno 0.05%. Después de contar las células en una cámara Neubauer, la suspensión celular fue ajustada a 1.25 x 10 5 células/ml, y colocándose en cada pozo de una placa de X10 4 células por pozo. El abasto viral fue diluido 8 veces con un factor de dilucón de 10. Cada dilución fue agregada a una monocapa de células Vero en los pozos y finalmente la placa fue incubada a 37 C en atmósfera húmeda con 5% de CO2. La formación de efecto citopático fue observado diariamente por 7 días. Infecciones in vivo En este trabajo se utilizaron ratones de la cepa Balb/C. Los ratones fueron depilados en el lomo con un agente comercial y se dejó reposar la piel de los animales por 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, la piel expuesta de estos animales fue lacerada con la ayuda de una navaja de rasurar sin filo, lo que provocaba una zona de irritación en donde fue colocado 10 µl con la cantidad de partículas infectivas necesaria para cada grupo. Los animales 4

5 fueron checados de manera diaria en cuanto a su peso y a la aparición de lesiones vesiculares en la zona de inoculación de los animales. Preparación de antígenos HSV1 Para obtener una preparación de antígenos rica en proteínas virales, se ultracentrifugó los sobrenadantes celulares para la obtención de partículas virales. El botón viral fue resuspendido en una solución salina enriquecida con inhibidores de proteasas. Las partículas virales fueron dispersadas con ayuda de un sonicador. El sobrenadante producto de este proceso fue utilizado como fuente de antígenos para los análisis de WesternBlot. La cantidad de proteína en los sobrenadantes fue cuantificada por el método de BCA. Antisueros Los antisueros empleados se obtuvieron de diferentes grupos de 10 ratones infectados con HSV1 y que recibieron distinto tratamiento. Las muestras de suero fueron obtenidas en el día 0, 7 y 14 postinfección. Formamos cuatro grupos experimentales: El primer grupo (GPO 1) fue infectado con HSV1 y tratado posteriormente por cinco días con TF específico al virus. El segundo grupo (GPO 2) fue tratado igualmente por cinco días con TF inespecífico y después infectado con HSV1. El tercer grupo (GPO 3) fue tratado por cinco días previo a la infección con TF específico a HSV1. Un cuarto grupo (GPO 4) fue tratado con solución salina e infectado con las partículas virales. Anticuerpos secundarios Se emplearon anticuerpos antiiga, antiigg1, antiigg2a y antiigm de ratón (Zymed Laboratorios Inc.), así como un anticuerpo antiinmunoglobulinas totales de ratón (Dako), todos conjugados a peroxidasa, como anticuerpos secundarios para el reconocimiento de las distintas subclases de anticuerpos presentes en los sueros de ratón. Western Blot Los geles en gradiente de concentración se prepararon mezclando las soluciones de acuerdo a lo indicado en trabajos previos. La mezcla del gel de resolución se vació en placas de vidrio para obtener geles de 0.75 mm de 5

6 grosor empleando el sistema Migthy Small II Slab Gel Electrophoresis Unit SE 250 (Hoefer Scientific Instruments) para formar un gradiente de 5 a 15%. Sobre el gel de resolución se vació la mezcla del gel concentrador al 5% e inmediatamente se colocó el peine con 10 dientes. Se dejó solidificar, se retiró el peine y se llenó la cámara con regulador de corrimiento. Los geles se corrieron a corriente constante de 20mA por placa hasta que la marca de colorante llegó al borde inferior del gel. Posteriormente, las proteínas separadas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas ya transferidas fueron secadas y se conservaron a 4º C hasta su uso. La membrana se regeneró con la solución de Triton X100 al 1% en PBS 1x durante 30 minutos a temperatura ambiente. El exceso de regulador de regeneración se eliminó con 3 lavados con PBS 1x. Posteriormente, las tiras fueron bloqueadas con leche descremada 3% (Svelty, Nestle) en solución salina boratos durante 30 minutos a temperatura ambiente. El exceso de solución de bloqueo se eliminó con 3 lavados con PBS 1x. A continuación se incubaron las membranas con el suero de los diferentes grupos de animales utilizando el sistema de revelado DECAPROB (Hoefer Scientifics Instruments). Cada anticuerpo se diluyó 1:300 en regulador de anticuerpo, y se dejó incubar durante toda la noche a 4º C. Tras el tiempo de incubación, el exceso de anticuerpo se eliminó con 7 lavados con PBST y 3 lavados posteriores con PBS 1x. Después de ello, se adicionó el anticuerpo secundario correspondiente. Para ello se realizó la dilución de cada anticuerpo en regulador de anticuerpo, dejándose en contacto con la membrana durante 1 hora a 37º C. Tras el tiempo de incubación, el exceso de anticuerpo se eliminó con 7 lavados con PBST y 3 lavados posteriores con PBS 1x. Finalmente, las membranas fueron reveladas con 3amino9etilcarbazolona (Sigma) como cromógeno y peróxido de hidrógeno al 30% (J.T. Baker) como sustrato para peroxidasa, dejando revelar en la oscuridad durante 10 minutos. La reacción fue detenida con agua destilada. 6

7 RESULTADOS Durante la primera parte del proyecto trabajamos en la parte del modelo de la infección con HSV1. En esta etapa establecimos la cepa de ratones que era idónea para realizar el trabajo, así como el esquema de tratamiento con los TF que fuera eficaz en el control de la infección. De esta manera observamos, que la cepa de ratones Balb/c era más propensa a la infección por HSV1, y que el tratamiento cinco días previos a la infección prevenía la diseminación de las partículas virales a órganos internos de los animales. De igual manera, se observó que el FT derivado de animales infectados con HSV1 (FT específico) era más efectivo en el control de la infección que FT derivado de ratones sin infectar (FT no específico). En el control de las enfermedades virales participan diversos mecanismos de la respuesta inmune. En este trabajo decidimos enfocarnos al papel que tienen los anticuerpos durante la infección, así como el analizar el efecto de los FT en el surgimiento de anticuerpos específicos a antígenos de HSV1. En primer lugar decidimos analizar el patrón de proteínas que eran presentados por diferentes fuentes de antígenos proteicos: proteínas expresadas en las partículas virales y proteínas virales expresadas durante la infección celular (Figura 1). En esta instancia observamos una mayor cantidad de proteínas provenientes del proceso infectivo (carril 3), que de las partículas virales (carril 2). En el resto del trabajo decidimos emplear los antígenos derivados de las partículas virales por ser menor el número de antígenos por analizar, además de enfocarnos en los anticuerpos que pueden tener una funcionalidad relevante en el control de la infección. 7

8 Carril Figura 1. Expresión de proteínas de diversas fuentes virales. Carril 1: Marcador de peso molecular. Carril 2: Proteínas de partículas virales. Carril 3: Proteínas de extractos celulares infectados con HSV1. En nuestro siguiente experimento, analizamos el patrón de proteínas que eran reconocidos por los sueros de los animales infectados. En primer lugar, se analizó el perfil de anticuerpos totales que eran reconocidos por los cuatro grupos experimentales (Figura 2). En general observamos un patrón similar de reconocimiento, aunque se observaron algunas pequeñas diferencias en el patrón de reconocimiento. Aunque en algunos individuos se observó una diferencia en el patrón de reconocimiento, pero el comportamiento no era homogéneo en todo el grupo, decidimos recortar el tipo de anticuerpos que estuvimos analizando y decidimos evaluar el efecto del tratamiento de EDL en la expresión de isotipos particulares de anticuerpos. 8

9 Figura 2. Patrón de reconocimiento de sueros de distintos grupos de ratones tratados con FT e infectados con HSV1. Grupo 1 HSV1 + FT específico, Grupo 2: FT no específico + HSV1, Grupo 3: FT específico + HSV1, Grupo 4: Solución salina + HSV1. A continuación evaluamos el efecto del FT en la producción de anticuerpos de los isotipos IgM, IgG e IgA que fueran específicos a antígenos de HSV1. En cuanto a la respuesta de IgM se observó un mayor reconocimiento en el grupo experimental 3, aunque seguía existiendo un patrón similar de reconocimiento (Figura 3) Figura 3. Patrón de reconocimiento de IgM de distintos grupos de ratones tratados con FT e infectados con HSV1. Grupo 1 HSV1 + FT específico, Grupo 2: FT no específico + HSV1, Grupo 3: FT específico + HSV1, Grupo 4: Solución salina + HSV1. En cuanto a la expresión de IgG se observó que el grupo de ratones tratados con FT modifican su patrón de antígenos reconocidos, mejorando la respuesta en contra de estos antígenos de manera específica (grupo 3) (Figura 4). 9

10 Figura 4. Patrón de reconocimiento de IgG de distintos grupos de ratones tratados con FT e infectados con HSV1. Grupo 1 HSV1 + FT específico, Grupo 2: FT no específico + HSV1, Grupo 3: FT específico + HSV1, Grupo 4: Solución salina + HSV1. Finalmente, en cuanto a la producción de IgA, observamos que la respuesta era diferente cuando se utilizaban TF específico a antígenos de HSV1 (figura 5). 1+ Figura 5. Patrón de reconocimiento de IgA de distintos grupos de ratones tratados con FT e infectados con HSV1. Grupo 1 HSV1 + FT específico, Grupo 2: FT no específico + HSV1, Grupo 3: FT específico + HSV1, Grupo 4: Solución salina + HSV1. De esta manera los resultados nos muestran que los extractos dializables de leucocitos poseen la capacidad de regular la repuesta inmune humoral y en particular la respuesta mediada por anticuerpos. Los mecanismos que se ven activados en este proceso son aún poco entendidos. Para ello, una mejor manera de evaluar este punto será involucrar otros modelos utilizados en Inmunología que disminuyan la complejidad determinada por el uso de microorganismos. 10

11 IMPACTO El impacto de este trabajo es demostrar que los extractos dializables de leucocitos tienen la capacidad de regular la producción de anticuerpos durante un proceso infeccioso. Este hallazgo puede dirigir nuevos usos clínicos que no han sido considerados por este tipo de producto, que actualmente es producido en la ENCB. 11