RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estimación de la Concentración Proteica del Filtrado de Cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv La curva estándar con la que se estimó la concentración proteica del filtrado de cultivo tuvo un coeficiente de regresión lineal de Con esta curva se estimó la concentración de proteína en el cultivo de Mycobacterium tuberculosis filtrado (sin células), obteniéndose una concentración promedio de µg/ml de cultivo; este es un rendimiento inferior al que se obtuvo en un trabajo similar realizado por Salazar-Lino (2008) con medio Sauton, que fue de 3.6 mg/ml, debido a que en el segundo se utilizaron volúmenes mayores de inóculo (5mL). Electroforesis de Filtrado de Cultivo El análisis electroforético en SDS-PAGE al 15% de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv mostró la presencia de 17 bandas proteicas con masas moleculares relativas que van desde los 16 kda hasta los 104 kda (Fig. 7). Entre las bandas reconocidas como fuertemente antigénicas posiblemente se encuentran el complejo antigénico de 85 de 30/32 kda (Kim y col., 1999), la proteína de 38 kda (Samanich y col., 2000) y la proteína de HSP de 65 kda (Mudaliar y col., 2006). Estandarización del Métodos Inmunoquímicos Para la identificación de Antígenos con Proteínas del Filtrado de Cultivo Electrotransferencia e Inmunodetección (Western-blot) En este trabajo se ensayaron dos esquemas para la estandarización del método de electrotransferencia e inmunodetección, para identificar antígenos del filtrado de cultivo líquido en Sauton de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, reactivos hacia anticuerpos presentes en el suero de una persona con tuberculosis activa. 25

2 Fig. 7. Perfil electroforético del filtrado proteico obtenido de medio líquido Sauton de Mycobacterium tuberculosis H37Rv de 4 semanas de incubación. Carril 1: Marcador de peso molecular; Carril 2: Proteínas de filtrado de cultivo. 26

3 La primera condición en ensayar fue el tiempo de electrotransferencia, donde el esquema de mayor tiempo, de 1 hora 10 minutos, 120 ma y 20 V, mostró una mayor resolución de las bandas sobre la membrana de nitrocelulosa. Por lo que se decidió utilizar esta condición de electrotransferencia de proteínas de filtrado de cultivo de Sauton para evaluar posteriormente el efecto de las condiciones de bloqueo, lavados, dilución de antisuero primario y secundario. Una etapa común en todos los procedimientos de inmunodetección es el bloqueo, que previene la unión inespecífica del sistema de detección a la membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado fondo o falsos positivos ( Por lo que en este trabajo se ensayaron 2 esquemas de bloqueo, el primero con 5% de leche descremada con 0.02% de Tween y el segundo con 5% de leche descremada, 0.5% de BSA y 0.02% de Tween, ambos con incubación de horas a 4º C. Este último esquema fue el que mostró menos fondo y permitió la mejor observación de las bandas reconocidas en el procedimiento de inmunodetección. Estos resultados se pueden comparar con un estudio similar (Samanich y col. (2001) en el que emplearon como solución de bloqueo de BSA al 3% en PBS, obteniéndose buenos resultados con una concentración más alta a la empleada en nuestro trabajo. La inmunodetección consiste en una serie de incubaciones con diferentes reactivos inmunoquímicos separados por lavados. Estos lavados son necesarios para remover los reactivos no unidos, reduciendo el fondo. Lavados insuficientes pueden ocasionar un fuerte fondo, pero cuando los lavados son excesivos puede disminuir la sensibilidad por la elución del anticuerpo o el antígeno fijado ( Por estas razones, el número de lavados establecido desde comienzo de estandarización de esta técnica, fue de 8 lavados de 5 minutos en agitación. 27

4 La elección de antisuero primario, en la fase de inmunodetección, depende del antígeno a detectar y los anticuerpos disponibles para dicho antígeno ( Por ello, se ensayaron las diluciones en un rango amplio para cubrir tales demandas, se hicieron ensayos con las diluciones 1:50, 1:100, 1:200 y 1:400, incubadas a temperatura ambiente en agitación, por 2 horas. Con las diluciones 1:50 y 1:100 no se obtuvieron señales que permitieran distinguir el patrón de bandas reconocido, pero con las diluciones 1:200 y 1:400 se observó claramente el patrón de bandeo reconocido, ya que empleando estas diluciones con antisuero secundario en dilución 1:6,000 (dilución óptima de anticuerpo secundario) se obtuvieron los mejores resultados. Pero fue la dilución 1:200 la seleccionada como óptima debido a que permite la visualización más clara de las bandas reconocidas (Fig.8). Para determinar la dilución óptima del antisuero secundario, se partió de la consideración de que, en general, se deben probar diferentes diluciones del conjugado frente a diluciones sucesivas del antisuero primario. Aquella dilución del antisuero que no produzca reacción inespecífica con muestras negativas e implique una clara distinción de las muestras positivas, es la dilución óptima ( Un ejemplo de este tipo de ensayos, es el que fue realizado por Samanich y col. (2001), en el que emplearon una dilución de antisuero primario de 1:100 y dilución 1:2,000 de anticuerpo secundario, condiciones que fueron favorables por la mayoría de los pacientes incluidos en el estudio. En este tipo de trabajos no se utilizan proteínas recombinantes ni proteínas puras; se ensayan fracciones de proteínas o inclusive mezclas completas de proteínas de filtrado de cultivo (Weldingh y col., 2005). Por ejemplo, en este estudio, empleando una mezcla de varios antígenos de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, se utilizó el anticuerpo secundario en dilución 1:2,000 pero con el antisuero primario en dilución 1:200, con muy buenos resultados en términos de reactividad con los cuatro sueros ensayados (Samanich y col. 1998). 28

5 Fig. 8. Inmunodetección revelada por quimioluminiscencia, utilizando dilución de antisuero primario 1:200 y antisuero secundario 1:6000. Carriles: 1) Marcador de Peso Molecular; 2) Inmunodetección con suero de una persona PPD (+); 3) Inmunodetección con suero de paciente con tuberculosis. 29

6 En nuestro trabajo se ensayaron 4 diluciones distintas del antisuero secundario: 1:2,000, 1:4,000, 1:6,000 y 1:8,000. Los resultados mostraron que la dilución 1:6,000 genera la mejor señal cuando se emplea la dilución 1:200 de anticuerpo secundario, ya que permitió observar claramente el patrón de bandeo reconocido por los sueros de la persona con PPD (+) y el paciente con tuberculosis, por lo tanto fue ésta dilución del antisuero secundario (1:6,000) la dilución recomendable para la realización de la inmunodetección. El patrón de bandas reconocidas por el suero de la persona PPD (+) fue distinto al del paciente con tuberculosis, el primero reconoció 5 bandas de aparentes pesos moleculares de 32, 39, 49, 58 y 65 kda, entre las que se pueden encontrar las proteínas de 30/32 kda (Kim y col., 1999), de 38 kda (Samanich y col., 2000) y la proteína HSP de 65 kda (Mudaliar y col., 2006). El suero del paciente con tuberculosis sólo reconoció una banda prominente de alrededor de 30 kda, que puede ser también miembro del complejo antigénico 85, ya que este complejo, así como las bandas de 81 y 65 kda, es reconocido por pacientes con tuberculosis no cavitaria (Samanich y col., 2001). Finalmente, es importante destacar que las diferencias en el reconocimiento inmune reportadas en los diferentes estudios, son debido a la gran heterogeneidad de la respuesta de anticuerpos en pacientes con tuberculosis (Weldingh, 2005), así como a las reacciones cruzadas provocadas por los antígenos compartidos por varias especies micobacterianas (Gennaro y col., 1998). Estandarización del Ensayo de Manchas (Dot blot) Para estandarizar el Dot blot, se inmovilizaron 0.7, 0.35 y µg/µl del antígeno (proteína de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv) en tiras de nitrocelulosa, con la finalidad de ensayar dos tiras con diferente cantidad de antígeno contra el suero de una persona sin tuberculosis con reacción positiva al PPD. De la misma manera, se cargaron dos tiras, para ensayar el suero de una persona con tuberculosis activa. En la figura 9, se puede observar que no hubo diferencia 30

7 significativa en la señal obtenida al incubar las tiras con 0.7, 0.35 y µg del antígeno proteico tanto en la tira ensayada con el suero de una persona con tuberculosis activa como en el suero positivo al PPD, pero sí se pudo observar la diferencia de señal entre la persona con enfermedad activa y la persona sin enfermedad pero con reacción positiva al PPD, siendo de mayor intensidad la del primero. Por lo anterior, se concluyó que para realizar el ensayo Dot blot deben inmovilizarse al menos 0.7 µg del antígeno (contenidos en 1 µl de la solución proteica), incubar la tira de nitrocelulosa con el antisuero primario, en dilución 1:50, durante 1 hora, a temperatura ambiente y en agitación, y con el antisuero secundario en dilución 1:1,000, por 1 hora, a temperatura ambiente. Las diferencias de intensidad en la mancha por parte de los antisueros del paciente como de la persona PPD (+), se deben a la concentración de los anticuerpos circulantes entre los diferentes sueros, observándose más intensa la mancha del paciente con tuberculosis, ya que las concentraciones de anticuerpos son mayores en pacientes que poseen la enfermedad (Chandramuki y col., 1989). 31

8 Fig.9. Resultados del Ensayo de Manchas revelado con diaminobencidina, utilizando tres diferentes concentraciones de antígeno (0.7, 0.35 y µg/µl), con dilución de antisuero primario 1:50 y antisuero secundario 1: