Cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel)

Transcripción

1 romatografía de exclusión molecular (filtración en gel) K av K av = V e - V o V t -V o log MW

2 Purificación de la HD de rata recombinante Etapa Actividad (µg 2 /h) Prot. total (mg) Actividad específica (pmol 2 /h µg pr) Purificación (veces) Rendimiento (%) Extracto crudo 4, , Precip. + Phenyl-seph. 1,7 243,2 7,16 2,3 36,7 DEAE-sephadex 0,87 3, ,9 Hidrixiapa. + filtr. 0,31 0,55 577, , HD Figura 2P. Etapas de purificación de HD recombinante. 1: Phenyl-Sepharose; 2: Macro-prep DEAE; 3: Hidroxiapatito.

3 Secuenciación de la ribonucleasa A Digestión con tripsina (14 fragmentos) 1. K 2. SR 3. DR 4. FER 5. NLTK 6. NVAK 7. ATGSSK 8. TTQANK 9. ETAAAK 10. YPNAYK 11. NGQTNYQSYSTMSITDR 12. HIIVAEGNPYVPVHFDASV 13. QHMDSSTSAASSSNYNEMMK 14. KPVNTFVHESLADVQAVSQK Digestión con NBr (5 fragmentos) 1. M 2. KETAAAKFERQHM 3. DSSTSASSSNYNEM 4. SITDRETGSSKYPNAYKTTQANKHIIV AEGNPYVPVHFADASV 5. KSRNLTKDRKPVNTFVLIESLADVQAV SQKNVAKNGQTNYQSYSTM 6, 11, 13 y 10, 12, 14 Tripina NBr Tripina NBr Tripina NBr Tripina NBr QHMDSSTSAASSSNYNEMMK... KETAAAKFERQHM...KSRNLTKDR KETAAAKFERQHMDSSTSAASSSNYNEMMKSRNLTKDR NGQTNYQSYSTM KPVNTFVLIESLADVQAVSQKNVAKNGQTNYQSYSTM KPVNTFVLIESLADVQAVSQKNVAKNGQTNYQSYSTM SITDR...HIIVAEGNPYVPVH SITDRETGSSKYPNAYKTTQANKHIIVAEGNPYVPVH SITDRETGSSKYPNAYKTTQANKHIIVAEGNPYVPVH..125 FDASV FDASV FDASV

4 Dependencia de la solubilidad del ph

5 Influencia de los pequeños iones sobre las interacciones entre los macroiones

6 Especificidades de varias endopeptidasas punto de corte H H R n-1 R n Enzima fuente especificidad omentario Tripsina Pancreas bovino R n-1 = R o K; R n P Altamente específico quimiotripsina Pancreas bovino R n-1 = F, W o Y; R n P rompe más lentamente para R n-1 = N, H, M o L Elastasa Pancreas bovino R n-1 = A, G, S o V; R n P Termolisina B. thermoproteolyticus R n = I, M, F, W, Y, V; R n-1 P ocasionalmente rompe cuando Rn = A, D, H, T; es termoestable Pepsina mucosa gastrica bovina R n = L, F, W o Y; R n-1 P es bastante inespecífica, ph óptimo = 2 Endopeptidasa V8 S. aureus R n-1 = E

7 Degradación de Edman N S +.. H 2 N H H H R 1 R 2 R 3 Fenilisotiocianato (PIT) -H - Polipéptido N.. H H H Feniltiocarbanil-polipéptido (PT-polipéptido) S R 1 R 2 R 3 R 1 F 3 H anhidro N S + + H 3 N H H N H Derivado Tiazolina H + R 2 R 3 Polipéptido sin el extremo N-terminal R 1 N S N H Feniltiohidantona-aminoácido (PTH-aminoácido)

8 adenas pesadas adenas ligeras Dominio de unión al antígeno Bisagra Dominio Fab Dominio Fc arbohidrato Antígeno Zona de corte con papaina Dominio de unión al antígeno Bisagra -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- Dominio Fab Dominio Fc Zona de corte con pepsina

9 Inmunodifusión en gel (uchternoly) A A B α-a B α-a Los antígenos A y B son inmunológicamente identicos Los antígenos A y B están estrechamente relacionados A A B α-a B α-a Ambos antígenos son reactivos pero con una relación lejana A es reactivo, pero B no lo es Inmunoelectroforesis A + - B En primer lugar las muestras A y B se somoten a una electroforesis antisuero El antisuero se coloca en el gel entre las dos muestras y se deja difundir. Se formaran arcos de precipitación con las bandas de cada mezcla que reaccionen con el antisuero

10 Transferencia Western Separación de proteínas en SDS-PAGE Transferencia a membrana Incubación con anticuerpos y revelado de la proteína marcadora P12 N17 NGF P12 N17 blot: α-py ERK1 ERK2 blot: α-p75 p75 NTR

11 Inmunoprecipitación Incubación con el anticuerpo Incubación con Proteína A Precipitación del complejo antígeno-anticuerpo-proteína A Análisis de los complejos en SDS- PAGE P12 N17 NGF IP: 203 blot: α-py p140 Trk p110 Trk P12 N17 blot: RTA p140 Trk p110 Trk

12 btención de anticuerpos monoclonales

13 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Ensayos de captura de anticuerpos Unión del antígeno a la fase sólida Unión del anticuerpo marcado al antígeno uantificación del anticuerpo Ensayos con dos anticuerpos Unión del anticuerpo a la fase sólida Unión del antígeno al anticuerpo Unión del anticuerpo secundario marcado uantificación del anticuerpo secundario Ensayos de captura de antígeno Unión del anticuerpo a la fase sólida Unión del antígeno marcado al anticuerpo uantificación del antígeno

14 Radioinmunoanálisis ontrol Muestra desconacida antidad fija de antigeno A radiactivo Se añade una cantidad desconocida de antigeno A sin marcar Se añade una cantidad fija de anticuerpos anti-a Se añade un agente precipitante (anticuerpo anti-inmunoglobulina) cpm control Se determina la radiactividad en los precipitados cpm desconocido cpm desconocido cpm control X 100% = % Ag* unido