ELISA y Western Blot

Transcripción

1 Universidad Central de Venezuela Facultad de Medicina Escuela de Medicina José María Vargas Cátedra de Inmunología ELISA y Western Blot Práctica Prof. Edwin Escobar [email protected]

2 Aplicaciones Diagnósticas de las Interacciones Ag/Ac ELISA

3 ELISA Ensayo de Inmunadsorción Ligado a Enzima Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Mide la cantidad de complejo Ag/Ac formado Utiliza reactivo detector conjugado a una enzima Reacción colorimétrica en presencia de sustrato cromógeno Intensidad de color proporcional a cantidad de complejo Ag/Ac

4 ELISA Indirecto Detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente Aplicaciones: Diagnóstico de Infección o exposición a microorganismos Detección de Autoanticuerpos Respuesta a Inmunizaciones/Vacunas Captura Diagnóstico de Infección por VIH-1 Marcador Identificado Detección Revelado Agregar Lavado Lavado Ag de VIH-1 Proteínas Recombinantes IgG anti-vih-1 Anticuerpos en Suero del Paciente Anti-IgG Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Cromógeno Inmunología de Kuby

5 ELISA Tipo Sándwich Detección de antígenos específicos en el suero del paciente Aplicaciones: Detección de Ag microbianos Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc. Determinación de Antígeno de Superficie del Virus de Hepatitis B Captura Marcador Identificado Detección Revelado Agregar Lavado Lavado Ac Anti-HBsAg HBsAg Antígeno en Suero del Paciente Anti-HBsAg Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Cromógeno Inmunología de Kuby

6 ELISA Competitivo El antígenos específico en el suero del paciente compite con el antígeno unido a la fase sólida para unirse al anticuerpo. La intensidad de color es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra Aplicaciones: Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc. Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-cg) Captura IgG Antih-CG Marcador Identificado Detección Revelado Agregar Lavado Lavado h-cg Proteínas Recombinantes h-cg Hormona en Suero del Paciente Anti-IgG Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Cromógeno Inmunología de Kuby

7 Técnica de ELISA Técnica de ELISA Ventajas Alta sensibilidad y alta especificidad Cuantitativa Relativamente económica Se pueden procesar hasta 96 muestras por placa Gran estabilidad. Limitaciones Positividad Vs. Infección activa: depende del tipo de anticuerpo evaluado. A menos que se evalúe presencia de antígenos en la muestra problema Dificultad de detección de Acs en pacientes con alguna inmunodeficiencia, en período de ventana o infectados por cepas desconocidas.

8 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 ELISA

9 Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección

10 Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 1ra. Generación Captura Marcador Identificado Detección Revelado Ag de VIH-1 Lisado Viral (Cultivo Celular) IgG anti-vih-1 Anticuerpos en Sangre del Paciente Anti-IgG Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Apropiado Sensibilidad Limitada Proteínas Celulares Contaminantes Reactividad Cruzada

11 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos Anticuerpos anti-vih-1 anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección

12 Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 2da. Generación Captura Marcador Identificado Detección Revelado Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes IgG anti-vih-1/vih-2 Anticuerpos en Sangre del Paciente Anti-IgG Proteína A Conjugados a Enzima VIH-1, VIH-2 Mejora Sensibilidad No Proteínas Celulares Contaminantes Mejora Especificidad Reacción de Color Sustrato Apropiado

13 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos Anticuerpos anti-vih-1 anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección

14 Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 3ra. Generación Captura Marcador Identificado Detección Revelado Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes IgM e IgG anti-vih-1/vih-2 Anticuerpos en Sangre del Paciente Ag Virales Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Apropiado VIH-1, VIH-2 Detecta IgM e IgG Detección más Temprana

15 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos Anticuerpos anti-vih-1 anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección

16 Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 4ta. Generación Captura Marcador Identificado Detección Revelado E Anti-p24 Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes Ag p24 IgM e IgG anti-vih-1/vih-2 Ac y Ag en Sangre del Paciente Anti-p24 Ag Virales Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Apropiado VIH-1, VIH-2 Detecta Antígeno Viral (p24) Detecta IgM e IgG Detección más Temprana

17 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos Anticuerpos anti-vih-1 anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección Neonatos de madres infectadas

18 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 WESTERN BLOT

19 Western Blot Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos celulares o de tejidos. Etapas: 1. Preparación de la muestra 2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de poliacrilamida) 3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa ) 4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

20 Western blot Aplicaciones: Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular Permite identificar antígenos inmuno-dominantes para vacunas. Estudiar perfil de citocinas. Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra. Factores de crecimiento Niveles de fosforilación, modificaciones post-traduccionales, etc. Diagnóstico: Prueba confirmatoria de VIH Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada enfermedad de las vacas locas Enfermedad de Lyme.

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22 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Algoritmo Recomendado CDC