Fundamento, etapas, estandarización y tipos de la pruebas de ELISA

Transcripción

1 Fundamento, etapas, estandarización y tipos de la pruebas de ELISA Armando Reyna Universidad Simón Rodríguez IDECYT, Centro de Estudios Biomédicos y Veterinarios, Laboratorio de Inmunobiología areyna@inmunobiologia.net.ve Universidad De las Fuerzas Armadas ESPE Departamento de Ciencias de la Vida Grupo de Investigación en Salud Animal y Humana GISAH

2 Ensayo inmunoenzimático Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA

3 Ensayo inmunoenzimático para la detección de anticuerpos (ELISA) Fue introducida por Voller en Es la prueba más empleada comercialmente para el diagnóstico de diferentes enfermedades, dopin, tecnología de los alimentos para buscar patógenos o subproductos. Puede llegar a utilizarse de rutina en laboratorios especializados y aplicarla a gran escala Varias modalidades: ELISA Indirecto (para la detección de Ac) ELISA COMPETITIVO ELISA SANDWICH (para la detección de antígeno)

4 ELISA ELISA Indirecto (Voller 1.977) Utiliza como antígenos extractos de microorganismos ó fracciones de los mismos absorbidas a microplacas., proteínas purificadas o recombinantes, LPS, Carbohidratos, etc. Muy sensible y puede detectar subtipos de anticuerpos, dependiendo del conjugado Es una prueba de rutina hoy día en muchos laboratorios En laboratorios veterinarios, se utiliza menos, pero cada vez más empresas emiten pruebas diagnóstica en formato ELISA y cada vez más son empleados

5 El conjugado es un anticuerpo unido covalentemente con una molécula marcadora (por ejem. Peroxidasa), el cual reconoce a su vez otra molécula de anticuerpo IgG Peroxidasa, sulfatasa, oro, etc

6 ELISA INDIRECTO

7 Pasos del ELISA Indirecto 1. Sensibilización con antígeno 2. Bloqueo con leche descremada al 5% 3. Adición de los sueros (bovinos y ovinos) 4. Adición de la anti-igg unida a peroxidasa 5. Adición del sustrato (ABTS o TMB) Lector de ELISA

8 ELISA Indirecto + -

9 ELISA ELISA COMPETITIVO Utiliza un Ac monoclonal específico que reconoce al antígeno. Es una técnica muy comúnmente utilizada en estuches comerciales, debido a su gran especificidad Ampliamente distribuida. Alta sensibilidad Alta especificidad (discriminativa)

10 Anticuerpos Monoclonales

11 Anticuerpos monoclonales (1975) Georges Köhler y Cesar Milstein Premio nobel 1984 Objetivo: Estudiaban la recombinación genética entre celulas

12 Definición Inmortalización de clones de células B secretoras de anticuerpos Anticuerpos monoclonales homogéneos y específicos Anticuerpos secretados por un solo clon de hibridoma ya que cada clon se deriva de una sola célula B. TODOS los anticuerpos secretados son idénticos.

13 Células de Bazo del animal inmunizado * Capaces de secretar anticuerpos con especificidad definida * Vida media limitada in vitro * HGPRT + (gen de la enzima Hipoxantina-Guanina- Fosforibosil-Transferasa (HGPRT)

14 Células tumorales: mielomas - Adaptados a crecer in vitro exponencialmente - Marcador de selección: deficiencia en el gen de la enzima Hipoxantina-Guanina-Fosforibosil-Transferasa (HGPRT) - No sintetizan ni secretan Igs propias - Fenotipo para la alta secreción de Igs - Capacidad para inducir tumores in vivo Ejemplos: P3/x63.Ag8.653, Sp2/0-Ag14, NS-1, NS-0

15 G. Köhler & C. Milstein (1975). "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 256 (5517): 495.

16 Etapas para la producción de anticuerpos monoclonales I Inmunización II Fusión IV Screening III Cultivo (plaqueo)

17 III Cultivo (plaqueo) Cultivo en P96 (placas de ELISA con tapa) Medio HAT IV Screening 20 días Clones viables, cultivo en medio HT. P12 IV Screening 15 días V Congelación 10 días Clones viables, cultivo en medio HT. Placas de Petri IV Screening

18 Pasos del ELISA Competitivo (celisa) 1. Sensibilización con antígeno 2. Bloqueo con leche descremada al 5% 3. Adición de los sueros + Mab 4. Adición de la anti-igg de raton unida a peroxidasa 5. Adición del sustrato (ABTS o TMB) Lector de ELISA

19 ELISA COMPETITIVO

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23 ELISA ELISA SANDWICH Antigenemia: Ag de secreción Microorganismos lisados por el sistema Inmune Menos empleado Más dificil de estandarizar comparándolo con otros ELISA

24 ELISA SANDWICH

25 Influencia del antígeno y del suero para la estandarización de la prueba de ELISA

26 ELISA ELISA CONVENCIONAL (Voller 1.977) Antígenos utilizados: Extractos totales. Proteínas recombinantes Proteínas purificadas Extractos parciales purificados Soluble

27 Absorbancias a 450 nm Prueba de diferentes concentraciones del antígeno frente a dos diluciones del suero 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 (1:100) (1:200) (1:100) (1:200) (1:100) (1:200) (0,5 mg/ml) (1 mg/ml) (2 mg/ml) Sueros

28 Influencia del Conjugado y del cromógeno para la estandarización de la prueba de ELISA

29 D.O. (405nm) D.O ( nm) Empleo de dos sustratos (ABTS y TMB) en el ELISA utilizando la MSP5r como antígeno y diferentes concentraciones del conjugado 3, , , ,5 0 1/ / / / /2500 1/5000 1/ /20000 Conjugate dilution ABTS ABTS Conjugate dilutions TMB TMB

30 O.D. (405 nm) O.D ( nm) Empleo de dos sustratos (ABTS y TMB) en el ELISA utilizando la T. evansi como antígeno y diferentes concentraciones del conjugado ABTS TMB 1,6 1,6 1,1 1,1 0,6 0,6 0,1 S1+ S2+ S3- S4- Ovine Serums 0,1 S1 + S2 + S3 - S4 - Ovine serums ABTS TMB

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32 Densidad óptica a 4 Estudio por ELISA de la cinética de anticuerpos anti-msp5r de tres bovinos infectados experimentalmente 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Punto de corte 0, Días post infección

33 Densidad óptica a 405 Estudio por ELISA de la respuesta anti-msp5r de una población bovina de origen venezolano 3 2,5 36% 49% 2 1,5 1 0,5 Punto de corte Sueros bovinos de zonas endémicas

34 Epidemiología

35 D.O (450 nm Epidemiología Ensayo inmunoenzimático de sueros Bovinos de la E.E. La Iguana Seroprevalencia de 93,7 % 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Número de sueros (Eleizalde et al. 2003)

36 D.O. Epidemiología Ensayo inmunoenzimático de sueros Bovinos de Rio Chico, Edo. Miranda Seroprevalencia de anaplasmosis Nº de animales 57,53 % Seropositivos a anaplasmosis

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39 DO 450 nm Epidemiología Ensayo inmunoenzimático de sueros ovinos de la E.E. La Iguana Seroprevalencia de % 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Sueros (Tavares et al. 2002)

40 Abs (45 Ensayo inmunoenzimático de sueros de caprinos de la E.E. La Iguana Epidemiología Seroprevalencia 59,25 % 2 1,5 1 0,5 0 Sueros (Nuñez et al. 2002)

41 PCR anaplasmosis

42 Densidad óptic Epidemiología Sueros de sus respectivas descendencia a diferentes horas. Análisis por ELISA de los promedios de los calostro de las vacas y de los becerros 0,6 Calostros Sueros de becerros 0,4 0, Horas después del parto

43 MSP5 purificada por la columna de afinidad MSP5r 14 9

44 Estandarización del ELISA utilizando la proteína recombinante y el suero de conejo anti E. coli Sensibilización con MSP5 Bloqueo con leche descremada 5% Adición de suero de conejo anti E. coli Adición de sueros Bovinos positivos (anti MSP5) y negativos Adición de anti IgG bovino unido a peroxidasa Adición del sustrato TMB MSP5r Contaminantes E. coli

45 Estandarización del ELISA utilizando la proteína recombinante y el suero de conejo anti E. coli Sensibilización con MSP5 1μg/ml Bloqueo Adición de suero anti E. coli 1/25, 1/50, 1/100 Adición de suero Bovino 1/100, 1/200, 1/400 Conjugado 1/5000, 1/10000, 1/20000,1/40000 Adición del sustrato TMB Adición de solución STOP Lectura a 450 nm MSP5r Contaminantes E. coli

46 D.O (450 nm) D.O (450 nm) Resultados Determinación de la concentración óptima de suero anti E. colii Conjugado 1/ Antígeno 2 µg/ml Suero bovino 1/100 Suero bovino 1/200 A B C D E A B C D E 1 0,9 1 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 0 0,04 0,02 0,01 Sin S.C Dilucion de suero anti E.coli 0 0,04 0,02 0,01 Sin S.C Diluciones de suero anti E.coli A suero hiperinmune B suero bovino infectado C D E sueros negativos franceses Eleizalde et al, 2004

47 D.O (450 nm) Resultados Curso temporal de infección seguida por ELISA con y sin suero anti E. coli. Cromógeno TMB. 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Se manas de infección + Suero - Suero Eleizalde et al, 2004

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49 Otras pruebas serológicas que atizan conjugados.

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51 Bell et al. Nature Reviews Microbiology 4, S7 S20 (September 2006) doi: /nrmicro1525

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57 Principio de la fluorescencia polarizada

58 Principio de la fluorescencia polarizada

59 Principio de la fluorescencia polarizada

60 Principio de la fluorescencia polarizada