Detección de virus. Cuantificación de virus. Producción de virus

Transcripción

1 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires LOS CULTIVOS CELULARES EN VIROLOGIA Elsa B. Damonte 2018

2 LOS CULTIVOS CELULARES EN VIROLOGIA Detección de virus Cuantificación de virus Producción de virus

3 INFECCIÓN Cultivo de Células Virus Efectos sobre las células Efectos sobre la multiplicación viral Virus citocídicos Virus no citocídicos Infección productiva Infección no productiva Detección de virus Cuantificación de virus Producción de virus

4 CICLO DE VIDA DE UN VIRUS Adsorción Entrada Desnudamiento Replicación del genoma viral Transcripción Traducción Ensamblaje Salida

5 Detección de virus Objetivo Poner en evidencia la presencia de virus en una muestra Virus citocídicos Detección de efectos citopáticos Virus no citocídicos Detección de macromoléculas virales

6 DETECCIÓN DE EFECTOS CITOPÁTICOS Alteraciones en la morfología de las células Redondeamiento y lisis, con desprendimiento de las células Formación de sincicios o policariocitos Cuerpos de inclusión citoplasmáticos o nucleares Focos de transformación

7 EFECTOS CITOPÁTICOS Metapneumovirus humano en células LLC-MK2 Redondeamiento y Lisis Virus herpes simplex-1 en células Vero Redondeamiento y lisis

8 FORMACIÓN DE SINCICIOS Virus herpes simplex-2 Virus respiratorio sincicial Virus Sarampión

9 CUERPOS DE INCLUSIÓN Virus rabia Reovirus

10 FOCOS DE TRANSFORMACIÓN Adenovirus

11 DETECCIÓN DE MACROMOLÉCULAS VIRALES Identificar productos de la multiplicación viral en la célula Proteínas antigénicas Inmunofluorescencia, Inmunoperoxidasa, ELISA, Hemoadsorción Enzimas Transcriptasa reversa Ácidos nucleicos Hibridación, PCR

12 INMUNOFLUORESCENCIA Control 12 h p.i. 48 h p.i.

13 HEMOADSORCIÓN Orthomyxovirus y Paramyxovirus no producen un efecto citopático muy evidente La hemaglutinina viral (HA) se expresa en la membrana celular El agregado de una suspensión de glóbulos rojos (GR) sobre la monocapa infectada permite la unión GR-HA

14 HEMOADSORCIÓN Células infectadas con virus paperas

15 Cuantificación de virus Determinación de efectos citopáticos Cuantificación de virus por métodos enumerativos o de dilución al punto final

16 PLACAS DE LISIS UFP : Unidad Formadora de Placas

17 ENSAYO DE PLACAS DE LISIS Virus 1) Infección de monocapa celular 2) Cubrir con metilcelulosa y nutrientes 3) Replicación en células adyacentes 4) Fijación y tinción con cristal violeta

18 Virus herpes simplex Titulación UFP/ml No. de placas Dilución muestra

19 El tipo de placa depende de cada virus Virus DENV-1 dengue-1 Virus DENV-2 dengue-2 Virus DENV-3 dengue-3 Virus DENV-4 dengue-4

20 Producción de virus Establecer las condiciones óptimas para obtener el máximo rendimiento de partículas virales infectivas -Tipo de célula -Curvas de crecimiento viral multiplicidad de infección tiempo de incubación condiciones de cultivo (ph, medio de cultivo, temperatura)

21 CURVA DE UN CICLO DE MULTIPLICACIÓN Log Unidades infecciosas/ml Virus intracelular 0, Horas post-infección Virus extracelular eclipse fase log salida Adsorción y penetración latencia

22 PRINCIPALES APLICACIONES DEL USO DE CULTIVOS CELULARES EN VIROLOGÍA Detección y cuantificación de virus Estudio de la multiplicación viral Aislamiento e identificación viral Diagnóstico virológico Evaluación in vitro de compuestos antivirales, agentes inactivantes, desinfectantes

23 EPIDEMIOLOGÍA DE SARS-CoV 8098 casos notificados 774 muertes Diseminación global de un virus respiratorio en humanos después de la transmisión a partir de un reservorio zoonótico -Rápida distribución geográfica (población móvil, tiempo de incubación de días)

24 AISLAMIENTO Y DETECCIÓN DE SARS-CoV TÉCNICAS -Cultivo celular (Efecto citopático, IFI) -Microscopía electrónica -RT-PCR y secuenciación ECP en células Vero infectadas con SARS-CoV a las 0 h (A), 24 h (B) y 48 h (C) post-infección ME de SARS-CoV Suero de paciente a los 9 (A), 12 (B) y 14 (C) días de hospitalización. IFI en células Vero infectadas con SARS-CoV

25 ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIVIRAL CONTRA DENV-2 EN CÉLULAS VERO 1 µg/ml 0.5 µg/ml 0.25 µg/ml µg/ml VC µg/ml 100 Inhibición (% ) CI 50 : 0.15 ± 0.01 µg/ml CC 50 > 1000 µg/ml concentración ( µg/ml)

26 Ensayo de citotoxicidad Cultivos de células animales en microplacas Incubación 2-7 días en medio de cultivo con diferentes concentraciones de la droga Cuantificación de viabilidad celular (recuento o MTT) CC 50 (concentración citotóxica 50): dosis de droga que reduce al 50% la viabilidad celular

27 Ensayo de actividad antiviral Cultivos de células animales en microplacas Infección con UFP de virus Incubación 2-15 días en medio semisólido con diferentes concentraciones de la droga Fijación de las células, tinción y recuento de placas CI 50 (concentración inhibitoria 50): dosis de droga que reduce 50% el número de placas

28 PRINCIPALES APLICACIONES DEL USO DE CULTIVOS CELULARES EN VIROLOGÍA Producción de virus Obtención de stocks de virus para purificación de partículas virales o subcomponentes Producción de vacunas Virus vivo atenuado Virus inactivado Subunidades virales Producción de vectores virales Producción de proteínas recombinantes Vacunas de nueva generación Terapia génica Estudios de caracterización del virus y sus componentes