11. MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DEL ROTAVIRUS. Actualmente existen diversos métodos en el mercado que pueden utilizarse

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Gustavo Iglesias Moya
hace 6 años
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1 11. MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DEL ROTAVIRUS Actualmente existen diversos métodos en el mercado que pueden utilizarse para el diagnóstico de rotavirus, las cuales pueden realizarse directamente a partir de la materia fecal, fundamentalmente buscando antígenos específicos del grupo A (VP6). 54 De tal forma que la técnica de elección dependerá del equipo y reactivos con que se disponga cada laboratorio de análisis clínicos. 54 Varios métodos para la identificación del rotavirus o antígeno del mismo en heces han sido desarrollados en la actualidad. Los métodos más usados son: microscopia electrónica, inmunoensayos enzimáticos como ELISA (Inmunoensayo ligado a la absorción de enzimas), y aglutinación en látex, en ciertas ocasiones se llega a utilizar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Microscopía Electrónica El descubrimiento de rotavirus mediante inmunoelectromicroscopia permitió caracterizar la morfología del virus y, consecuentemente utilizar la microscopia electrónica. 58 Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los viriones presentes en muestras clínicas. La limitación del método además del costo del microscopio. 59 Es necesaria una alta concentración de viriones (aproximadamente 109 partículas virales/ml. dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible

2 Esto hace que sea una técnica poco utilizada, más aún con el desarrollo de técnicas alternativas de utilidad similar. 59 El microscopio electrónico nos permite obtener resultados positivos rápidos de muestras de materias fecales de pacientes con diarrea, ya que tanto los rotavirus como los adenovirus, coronavirus y calcivirus pueden ser visualizados e identificados como causantes de enfermedad. 59 También existen otras muestras en las que puede ser de gran utilidad la microscopia electrónica ellas son: líquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos, mediante coloración negativa. 59 Si la concentración de virus en la muestra clínica es baja, y por tanto no visible directamente por microscopio electrónico, se pueden utilizar técnicas que aumenten la visualización, como lo es la inmunoelectromicroscopia, que consiste en el agregado de anticuerpos específicos antivirales y la formación de agregados de partículas que son más fácilmente visibles que las partículas solas Inmunocromatografía Son inmunoensayos en fase solida donde se fijan los anticuerpos específicos para el virus en la superficie de una matriz, tubo o microplaca. 60 Se emplea como sistema de amplificación del conjugado, el oro coloidal para aumentar la sensibilidad del método. Posteriormente se pone en presencia del suero o muestra que contiene el antígeno que se quiere demostrar; una vez que ocurre la reacción antígeno-anticuerpo la cual es observada por la acumulación de oro coloidal del conjugado en el papel de nitrocelulosa), se hace 48

3 un lavado y se agrega un anticuerpo marcado de captura, que depende de la marcación del anticuerpo observar figura Los más conocidos son: ELISA (Inmunoensayo ligado a la absorción de enzimas), y la aglutinación en látex dependiendo del trazador que se utilice para evidenciar la reacción

muestra Anticuerpo de captura Contra anticuerpo Anticuerpo de

4 C T Fundamento de inmunocromatografía para detección de antígenos Anticuerpos de detección Marcados con oro coloidal G G Antígenos en muestra Anticuerpo de captura Contra anticuerpo Anticuerpo de captura Contra anticuerpo Figura 11. Técnica de inmunocromatografía

5 11.3 Elisa (Inmunoensayo ligado a la absorción de enzimas) El método de Elisa es capaz de detectar 10 6 partículas virales por gramo de heces, lo cual lo hace más sensible que el microscopio electrónico. 60 El uso de anticuerpos monoclonales incrementa aún más la sensibilidad y especificidad de esta prueba. 60 Existen una gran cantidad de métodos de ELISA comerciales los cuales varían en cuanto a sensibilidad y especificidad dependiendo de la casa comercial y si la prueba está hecha con anticuerpos monoclonales, policlonales o ambos. 60 Los ELISA comerciales detectan únicamente rotavirus del grupo A (utilizan anticuerpos anti-vp6). Los cuales tienen como finalidad el diagnóstico de la infección por rotavirus mediante el uso de anticuerpos monoclonales que detectan la existencia del antígeno vírico VP6 (cápside interna del virión) en muestras de heces fecales. 60 Los cuales generan complejos inmunes que pueden ser visibles incluso mediante microscopia electrónica. Con esta técnica se es posible procesar una gran cantidad de muestras clínicas de forma rápida y sencilla. 60 No obstante puede haber resultados falsos positivos, por lo que se recomienda que aquellas muestras positivas obtenidas fuera del periodo epidémico se repitan nuevamente, la figura 12 muestra la placa donde se realiza el estudio para la detección de RV. Las ventajas de esta prueba permiten obtener resultados de una forma rápida y fácil, tiene poca complejidad técnica, es de fácil manipulación, emplea pocos reactivos y proporciona una información diagnóstica rápida, debido a que los resultados se obtienen en un periodo de 30 minutos, lo cual resulta muy conveniente para el tratamiento de esta enfermedad. 60,61 51

6 Figura 12. ELISA. Detección de antígeno viral en heces para Rotavirus. 62 Pozos color amarillo positivos a rotavirus. Pozos incoloros negativos a rotavirus. 52

7 11.4 Aglutinación de Látex. Esta técnica se usa comúnmente para la demostración de antígenos de rotavirus en materias fecales. 63 Las partículas de látex son esferas de poliestireno que se unen fácilmente al fragmento cristalizable (Fc) de moléculas de inmunoglobulina G (IgG) o inmunoglobulina M (IgM), esta última es mucho más eficiente en aglutinar partículas naturales. 63 Los fragmentos de unión del anticuerpo (FAb) quedan expuestos y son capaces de unirse al antígeno que se encuentra en la muestra. 63 Cuando los antígenos tienen varios epítopes (o estructuras antigénicas repetitivas), los anticuerpos multivalentes acoplados a múltiples partículas de látex se unen al antígeno y se produce un entramado de las partículas de látex que dan como resultado una aglutinación visible. 63 Esta es fácil de realizar, requiere sólo unos minutos y no necesita equipo, la imagen 13 muestra donde el resultado se puede leer a simple vista. Sin embargo, ofrece como desventaja la presencia de reacciones cruzadas sobre todo con otros antígenos en la muestra y también ocurren interferencias por el fenómeno de prozona, en el que un exceso de anticuerpos no permite la formación del entramado. 63 Esta técnica se usa comúnmente para la demostración de antígenos de rotavirus en materias fecales

8 Figura 13. Aglutinación de látex 62 54

9 11.5 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Conocida como PCR (siglas en inglés de polymerase chain reaction) mediante esta técnica se pueden encontrar cantidades mínimas del ácido nucleído del rotavirus en muestras de heces fecales gracias a la amplificación selectiva y repetitiva de una secuencia de nucleótidos de un microorganismo determinado que hace un proceso de síntesis de ADN. 64 En la Actualidad se han desarrollado técnicas de PCR para muchos de los virus productores de gastroenteritis, aunque no se utilizan de forma rutinaria. 64 Estas técnicas son más sensibles que los métodos de inmunoensayo, se suelen utilizar para confirmar los resultados de otras técnicas y son también útiles para el estudio de muestras como LCR o suero y muestras ambientales, como ocurre en el caso de rotavirus con las técnicas de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). 64 Vemos en la figura 14 los tres pasos fundamentales de la PCR: a) La desnaturalización del ADN en la muestra, lo que se logra al someterlo a altas temperaturas (95º C) para lograr la separación de las cadenas. b) La hibridización de los cebadores (a 55º C) que son unos fragmentos cortos de ADN complementarios a los extremos 5' y 3' de las secuencias por amplificar y a partir de los cuales se inicia la síntesis. 55

10 1= Primer paso. Mezcla de reacción 2= Desnaturalización 3= Hibridación y extensión 5= Desnaturalización 6= Hibridación y extensión 7= ADN duplicado 4= ADN duplicado FIGURA 14. PCR 56

11 c) La extensión de estos cebadores por la enzima ADN polimerasa (a 72º C) termoestable (polimerasa extraída de la bacteria Thermus aquaticus) que produce 64, 65 dos bandas de ADN que son idénticas a la banda blanco original. 57

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