Pruebas Rápidas para la Detección de Antígenos Microbianos. Lic. TM Luis Alvarado Rios

Transcripción

1 Pruebas Rápidas para la Detección de Antígenos Microbianos Lic. TM Luis Alvarado Rios

2 Antígenos Un antígeno es una molécula de superficie celular, que puede inducir la formación de anticuerpos. Epítopo, es la zona del antígeno donde se une el anticuerpo. Cada epítopo está definido por su anticuerpo, los cuales interactúan por complementariedad espacial. Las proteínas son las principales moléculas antigénicas

3 Anticuerpos Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por un tipo celular del sistema inmune, los anticuerpos tienen una altísima afinidad por sus antígenos correspondientes. Anticuerpos: Defensa natural Utilidad terapéutica Utilidad Diagnóstica Marcador de Infección o exposición. Detección de antígenos

4 Diagnóstico Microbiológico Conjunto de procedimientos empleados para establecer la etiología del agente responsable de una enfermedad infecciosa. Diagnóstico Microbiológico Directo. Implica la demostración del agente, sus metabolitos o componentes antigénicos en los fluidos orgánicos. Diagnóstico Microbiológico Indirecto. Implica la demostración de la huella que el agente ha dejado en su contacto con el sistema inmune.

5 Métodos en el Diagnóstico Microbiológico Directo: Tinciones Cultivos Métodos Inmunológicos Métodos Moleculares Indirecto Detección de Anticuerpos

6 Métodos Inmunológicos en el Dx. Microbiológico Aglutinación Precipitación ELISA Inmunofluorescencia Inmunocromatografía-Lateral Flow.

7 Pruebas Rápidas en el Diagnóstico Microbiológico El diagnóstico microbiológico requiere ser oportuno y confiable. La microbiología convencional suele requerir un tiempo prolongado para obtener el diagnóstico. Las pruebas inmunológicas permiten acortar el tiempo requerido para el diagnóstico. No recuperan el agente etiológico, solamente detectan su presencia. No requieren equipos sofisticados en su procedimiento. Su principal desventaja la lectura subjetiva, la disponibilidad en el mercado y el costo.

8 Pruebas Rápidas en el Diagnóstico Microbiológico Una prueba rápida ideal es aquella que brinda resultados en corto tiempo, no requiere mayor entrenamiento para su realización e interpretación, no requiere instrumentación, de fácil conservación, de bajo costo y disponibilidad en el mercado. Debe tener un rendimiento adecuado en cuanto a sensibilidad y especificidad.

9 Sensibilidad Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo. Es la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo. La sensibilidad es, la capacidad del test para detectar la enfermedad.

10 Especificidad Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano. Es la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo. Se puede definir la especificidad como la capacidad del test para detectar a los sujetos sanos.

11 Métodos Inmunológicos en el Dx. Microbiológico

12 Aglutinación Reacción Ag-Ac donde el antígeno esta formando parte de células, bacterias o se encuentra unido a partículas inertes. La reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado. Serotipificación bacteriana. Látex. Partículas de poliestireno de µm de diámetro. Coaglutinación. Staphylococcus aureus COWAN I, proteina A. Hemaglutinación.

13 Aglutinación de Látex Rotavirus. Meningitis. Antígenos bacterianos. Antígeno capsular de Cryptococcus.

14 Rotavirus Pertenece a la familia de los reovirus, se clasifican en serogrupos de la A a la G. Rotavirus grupo A es una de las principales causas de diarrea infantil severa en niños de 6 a 24 meses. Pruebas diagnósticas: Látex Elisa Inmunocromatografía

15 Rotavirus Látex

16 Rotavirus Látex Test Rápido para la detección de rotavirus grupo A en heces Ac. Polivalentes de conejo contra Rotavirus Grupo A, ligados a partículas de látex Sensibilidad frente a PCR 97.2% Especificidad frente a PCR 97.1% Periodo: Enero Marzo - Niños menores 2 años % 4% 2%

17 Meningitis. Antígenos Bacterianos Test Látex para detección de polisacáridos capsulares solubles en LCR, suero y orina. Anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales de ratón. Tratamiento previo de la muestra con calor. BM 100ºC. Especificidad entre 97% y 100%

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19 Meningitis. Antígenos Bacterianos Detección de los siguientes agente etiológicos Haemophilus influeza b Streptococcus pneumoniae Streptococcus grupo B Neisseria meningitidis (A, B, C, Y, W135) Escherichia coli K1

20 Meningitis. Antígenos Bacterianos

21 Cryptococcus neoformans Hongo levaduriforme capsulado Hábitat ambiental, excretas de aves Ingreso por vías respiratorias Diseminación en inmunosuprimidos Infección frecuente en pacientes HIV

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23 Antígeno de Cryptococcus Detección del antígeno polisacárido capsular glucuronoxilomanano (GXM). Sensibilidad y especificidad 100% Tratamiento previo de las muestras. BM 100ºC. Muestras de suero tratamiento con la enzima pronasa. Efecto de prozona Enero Marzo pruebas 6 positivos (aprox 10%)

24 Cryptococcus neoformans

25 Precipitación Participan Ag y Ac solubles que van a formar inmunocomplejos que precipitan cuando están en proporción equivalente. La precipitación es máxima donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente)

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29 Inmunodifusión doble Utilizada para detectar Anticuerpos generados en micosis invasivas Aspergillus Coccidioides Histoplasma Candida

30 ELISA ELISA: competitivo no competitivo Indirecto detección de anticuerpos Sándwich o de Captura detección de antígenos

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32 Campylobacter Es uno de los principales agentes causales de diarrea en niños. El Dx. de laboratorio se puede realizar con un frotis coloreado. Útil en pacientes que han iniciado el tratamiento antibiótico, pacientes con baja carga bacteriana. Elisa de captura. Anticuerpo policlonal de conejo contra antígeno específico de Campylobacter jejuni Sensibilidad 100% Especificidad 99%

33 Campylobacter ELISA

34 Clostridium difficile toxinas A y B Elisa de captura de antígenos de toxina de A y B de C. difficile a partir de muestras de heces.

35 Imunocromatografía-Lateral Flow Pruebas de gran desarrollo en los últimos años. Posibles de implementar en estaciones de campo. No requieren mayor entrenamiento ni equipamiento. Resultados rápidos ( minutos) Útiles para detectar antígenos y anticuerpos

36 TÉCNICA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA C T S ESQUEMA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS Anticuerpos de detección marcados con Oro Coloidal Antígeno en muestra Anticuerpo de Captura contra anticuerpo de detección Anticuerpo de Captura contra antígeno específico TIRA NITROCELULOSA

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38 Estreptococo ß-hemolítico grupo A Los estreptococos del grupo A son la principal causa de Faringitis bacteriana. Un diagnóstico oportuno pueden evitar las enfermedades post estreptocócicas: fiebre reumática, glomerulonefritis. Las pruebas diagnósticas: Cultivo Inmunocromatografía

39 Estreptococo ß-hemolítico grupo A Inmunoensayo, detección de polisacáridos de grupo A con anticuerpo policlonales de conejo. Extracción del antígeno: tratamiento del hisopado con nitrito de sodio y ácido acético. Detección 1x10 5 UFC/test

40 Estreptococo ß-hemolítico grupo A Enero - marzo pruebas 7 positivos (10%)

41 Virus Respiratorios Las infecciones virales son las responsables de la mayoría de infecciones respiratorias altas. Virus de la Influenza, Adenovirus, Virus Respiratorio Sincicial. Importantes por su patogenicidad y capacidad de causar brotes y epidemias. Pruebas diagnósticas. Cultivo. Inmunofluorescencia Inmunocromatografía

42 Influenza A Test inmunocromatográfico, con anticuerpos monoclonales de pollo frente a la nucleoproteina del virus Influenza A. Buffer de extracción con EDTA y nitrito de sodio. Importante. Colección de muestra nasofaríngea Detectabilidad 7.2 x 10 6 pv/ml Sensibilidad especificidad 76.6 % 100% frente RT-PCR 96.9 % 100% frente IFI

43 Influenza A Enero - marzo pruebas 15 positivos (16%)

44 Toxina A de Clostrium difficile C. difficile es una causa importante de diarrea asociada a antibióticos. Puede causar una colitis pseudomembranosa. Toxinas de C. difficile Toxina A: Enterotoxina. Toxina B: Citotoxina in vitro. Pruebas Diagnósticas Aglutinacion Látex. Detecta antígenos de C. difficile no de la toxina Citotoxicidad en cultivo celular Inmunocromatografía Elisa

45 Toxina A de Clostrium difficile

46 Toxina A de Clostrium difficile Límite de detección: 1.38 ng/ml Sensibilidad 90% Especificidad 99%

47 Gracias por su atención