PRUEBAS PARA EL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS EMPLEADAS EN LA PRACTICA CLINICA II

Transcripción

1 PRUEBAS PARA EL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS EMPLEADAS EN LA PRACTICA CLINICA II Juan Carlos Rodríguez Díaz S. Microbiología Hospital General Universitario de Elche

2 Métodos diagnósticos Serología Se basa en al detección de anticuerpos del paciente mediante ensayos in vitro Métodos: Aglutinación IFI: Inmunofluorescencia indirecta EIA: Enzimoinmunoensayo Western Blot Tipos de inmunoglobulinas Ig G: Se mantiene positiva toda la vida del paciente (puede cuantificarse) IgM. Sólo se mantiene positiva en la fase aguda de la enfermedad (semanas o meses)

3 Métodos diagnósticos

4 Métodos diagnósticos Detección por reacción en cadena de la polimerasa Sirve para detectar la presencia de los virus 1.- Separación de las cadenas 2.- Unión de los cebadores y la diana 3.- La Taq polimerasa genera de una nueva cadena

5 Herpesvirus Virus herpes 1, 2, 6 y 8 Detección del virus por PCR Virus Epstein Barr Mononucleosis infecciosa: Paul Bunnell: Antígenos no específicos Detección de IgM frente al VCA (Virus capside antigen) Reactivaciones en inmunodeprimidos Detección del virus por PCR Varicella-zoster Varicella: IgM Zoster: PCR de las lesiones

6 Citomegalovirus Herpesvirus Infección en inmunodeprimidos: Cuantificación del los virus en sangre Detección de antígenos en leucocitos del paciente: Técnica en desuso; sustituida por PCR en sangre Enfermedad en inmunodeprimidos: Detección de virus por PCR en diferentes muestras Mononucleosis infecciosa en inmunocompetentes: Ig M

7 Papilomavirus Genotipos Hay más de 100 diferentes. Se asocian a: Genotipos de bajo riesgo: Patologías benignas: verrugas genitales o no genitales Genotipos de alto riesgo: Contribuyen a la generación de procesos cancerígenos: cuello de útero, faringe, etc. Clasificación Alto riesgo: 16, 18, 31, etc Bajo riesgo: 6, 8, etc Diagnóstico Detección y genotipado del virus por PCR

8 Hepatitis A Marcadores serológicos Ig M: Aparece en la infección aguda y se mantiene 3-6 meses, por lo que es el que se emplea en el diagnóstico. Se detecta mediante ELISA Ig G: Indica contacto previo con el virus. Sólo útil en estudios de prevacunación y seroprevalencia. Se detecta mediante ELISA

9 Marcadores serológicos. Hepatitis A

10 Hepatitis B. Marcadores serológicos H. Aguda H. Curada H. Crónica HBsAg HBeAg AntiHBc (IgM) AntiHBc AntiHBs AntiHBe / Portador Pre-core

11 Hepatitis B. Marcadores serológicos

12 Hepatitis B. Marcadores serológicos

13 Hepatitis C. Diagnóstico Técnica de cribado: Detección de anticuerpos totales mediante ELISA Los anticuerpos aparecen 4-6 semanas postinfección, pero en algunos casos pueden retrasarse meses. Todos los resultados positivos deben ser confirmados Pruebas confirmatorias: Inmunoblot o PCR

14 Hepatitis C. Genotipado El genotipo del virus influye en la respuesta al tratamiento (1b es el que peor responde) Se realiza mediante una amplificación por PCR del fragmento variable y por hibridación posterior con sondas fijadas en un papel de celulosa (LIPA)

15 Hepatitis C. Genotipado

16 Hepatitis D. Marcadores serológicos Solo se debe buscar este agente si existe presencia de HBsAg en suero del paciente (hepatitis B aguda, portador o hepatitis crónica) Se detecta mediante la busqueda de anticuerpos totales mediante ELISA Mediante PCR se detecta la presencia de virus en suero

17 Pruebas diagnósticas de cribado Detecta conjuntamente Ac y Ag frente al HIV- 1, HIV-2 y subgrupo 0 Generalmente mediante detección de anticuerpos en suero mediante ELISA Pruebas de EIA (enzimo-inmunoensayo) de membrana: Pruebas rápidas

18 Pruebas diagnósticas de confirmación Todos los sueros positivos deben ser confirmadas por Western Blot Las proteínas del virus se separan en una tira de nitrocelulosa (incluye proteinas del HIV_1 y HIV-2). Se considera un suero positivo si hay anticuerpos frente a dos de las tres proteínas más importantes del virus (gp160, gp120, gp41) Si no cumplen los criterios, se llama WB indeterminado

19 Western Blot

20 Otros virus RNA Rubéola Detección de IgM PCR del virus en líquido amniotico en infecciones congénitas Sarampion: Detección de IgM PCR del virus en orina o exudado nasofaringeo Parotiditis Detección de IgM PCR del virus en saliva

21 Virus respiratorio sincitial (VRS) y metaneumovirus Clínica Infección de vía respiratorias inferiores y superiores Bronquiolitis en neonatos Diagnóstico Detección de antígenos en muestras respiratorias PCR en muestras respiratorias

22 Virus de la gripe Caracteristicas principales Producida por los virus influenza A y B Infección viral estacional Las pandemias son producidas por influenza A Subtipos antigénicos Pueden tener diferentes tipos de hemaglutinina (H1, H2, H3, ) y de neuraminidasa (N1, N2, N3, ) Se nombran indicando las dos proteinas: H1N1, H3N2. Diagnóstico Detección de antígeno específico de A ó B (poco sensible) PCR múltiple en muestras respiratorias para detectar: Gen común a todas las cepas de gripe Gen común a todas las cepas de gripe A Gen específico de cada subtipo

23 Enterovirus Virus incluidos Coxsackie Echovirus Enterovirus Clínica Manifestaciones neurológicas Meningitis (la mayor parte de las meningitis de la infancia) Encefalitis y mielitis (poliomielitis like) Manifestaciones cutáneas Miopericarditis Conjuntivitis aguda hemorrágica Manifestaciones gastrointestinales Diagnóstico PCR y cultivo viral

24 Virus productores de gastroenteritis Virus Rotavirus Adenovirus Calicivirus: norovirus y sapovirus Astrovirus Torovirus Virus Aichi (kobuvirus) Diagnóstico Detección de antígenos de rotavirus, adenovirus y astrovirus PCR y microscopia electrónica

25 Diagnóstico microbiológico de las infecciones causadas por micobacterias JUAN CARLOS RODRÍGUEZ S. MICROBIOLOGÍA HOSPITAL GENERAL UNIVERSITARIO DE ELCHE

26 Mycobacterium

27 Características de los microorganismos del género Mycobacterium Bacilos aerobios curvados No se tiñen por la coloración de Gram Tienen ácidos micólicos en la pared, por lo que son ácido-alcohol resistentes Crecimiento lento (tiempo de generación entre 2 y 20 horas) y medios especiales El género incluye más de 60 especies, algunas patógenas y otras saprófitas Necesitan tratamientos especiales y no responden a los antibióticos habituales

28 Características de los microorganismos del género Mycobacterium No crecen en los medios de cultivo habitualmente utilizados en los laboratorios de Microbiología. Hay que solicitar expresamente su aislamiento!! Mediante la tinción de Gram no se visualizan, hay que hacer tinciones especiales! Los cultivos tardan semanas

29 Mycobacterium tuberculosis Hay que diferenciar entre: Infección tuberculosa o tuberculosis latente: Nuestro sistema inmune ha estado en contacto con el microorganismo pero el paciente no ha sufrido ninguna alteración clínica Enfermedad tuberculosa: El paciente presenta signos y síntomas de tuberculosis

30 Infección tuberculosa El Mantoux presenta reacciones cruzadas con: Vacunación Otras micobacterias no tuberculosas

31 Alternativas al Mantoux IGRAs (Interferon gamma release assay): Quantiferon y T-spot. Se basa en que dos proteínas de M. tuberculosis (ESAT-6 y CFP-10) estimulan al sistema inmune e inducen una fuerte producción de IFNgamma por las células CD4 Estos antígenos están ausentes en la cepa vacunal y en la mauoria de las micobacterias no tuberculosas Excepto M. kansasii, M. marinum y M. szulgai

32 Muestras a procesar en función de la localización de la infección Pulmonar: 3 muestras de esputo de calidad o muestras invasivas Linfática: Punción del ganglio Pleural: Líquido o biopsia pleural Genitourinaria: 3 muestras de orina de tres días (más de 25 ml) Ósea: Material quirúrgico TB Miliar: Muestras respiratorias, orina, sangre, LCR y otras muestras Meningea: LCR Infección diseminada por M. avium: Muestras respiratorias, sangre, heces y médula ósea Muestras de piel y tejidos blandos:biopsia o punción, con incubación de los cultivos a 30ºC (M. marinum) Sospecha de M. genavense: Incluir medios líquidos

33 Muestras pulmonares invasivas También pueden utilizarse muestras invasivas: Aspirado bronquial (BAS) Lavado broncoalveolar (BAL) Cepillado bronquial Biopsia transbronquial Aspirado transtraqueal Biopsia pulmonar, obtenida quirúrgicamente Los esputos obtenidos en los días siguientes a estos procedimientos son muy rentables Los aspirados gástricos deben procesarse o neutralizarse rápidamente con carbonato cálcico para neutralizar el ácido clorhídrido estomacal

34 Tinción Se basa en demostrar la existencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en la muestra

35 Tinción La tinción de Ziehl Neelsen utiliza fuschina y azul de metileno y se observa a 1000 aumentos en microscopio óptico La tinción de auramina se observa a 200 aumentos en microscopio de fluorescencia

36 Tinción La sensibilidad en muestras respiratorias es de 50-75% dependiendo de: Calidad de la muestra Tipo de lesión del paciente La sensibilidad en muestras extrarespiratorias es mucho más baja, dependiendo del tipo de muestra Las dos tinciones tienen rentabilidad semejante No diferencia las especies del género

37 Cultivo Puede hacerse en medios sólidos o líquidos Se incuban 2 meses, aunque suelen ser positivos entre 2 y 4 semanas. El rango de crecimiento está entre 2 días y 8 semanas. Se incuban a 37ºC salvo algunas excepciones (biopsias cutáneas con sospecha de infección por M. marinum) Los medios sólidos se leen cada semana, mientras que los líquidos tienen lectura diaria automatizada Siempre hay que hacer cultivo porque mejora Sensibilidad: Detecta casos con tinción negativa Especificidad: Permite identificar las micobacterias no tuberculosas Permite estudiar la sensibilidad de la cepa mediante el antibiograma

38 Colonias de Mycobacterium

39 Nuevos métodos diagnósticos Basados en la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR) Más útiles en: Muestras con pocas bacterias, como las extrapulmonares Muestras pulmonares con tinción negativa Aumentar la rapidez diagnóstica Complemento de los medios líquidos Permite detectar simultaneamente algunas resistencias antibióticas Un resultado negativo no descarta la infección aunque tienen buena sensibilidad No sustituye a los métodos tradicionales