1. RESUMEN 9 2. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Síndrome Antifosfolípidos.. 12

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1 INDICE N Página. 1. RESUMEN 9 2. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Síndrome Antifosfolípidos Generalidades de Anticuerpos Antifosfolipidos (afl) Anticuerpos Anti-β2GPI Mecanismos trombogénicos Alteración de reacciones hemostáticas Activación Celular Activación plaquetaria Activación de Células Endoteliales Activación de Monocitos Alteración de Células trofoblásticas Activación del complemento

2 5. MATERIALES Y MÉTODOS Protocolo de inmunización ELISA anti-β2gpi Purificación anticuerpos anti β2 GPI Cromatografía de afinidad para purificación de IgG Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) Western Blot Agregación plaquetaria Agonista plaquetario Toma de muestra Obtención de concentrado plaquetario Protocolo para curvas de Agregación plaquetaria Análisis estadísticos de los resultados obtenidos RESULTADOS ELISA Anti- B2GPI a plasma de ratones inmunizados Cromatografía de afinidad para purificación de IgG, Cromatografía de afinidad para purificación de IgG anti- β2 GPI Western Blot Agregación plaquetaria. 55 3

3 7. DISCUSIÓN CONCLUSIÓN BIBLIOGRAFÍA 64 4

4 INDICE DE TABLAS N Página. TABLA N 1: ANTÍGENOS RECONOCIDOS POR ANTICUERPOS 15 ANTIFOSFOLÍPIDOS TABLA N 2: VOLUMENES UTILIZADOS DE LOS REACTIVOS 37 PARA PREPARAR LAS SOLUCIONES DEL GEL CONCENTRADOR Y DEL GEL SEPARADOR. TABLA N 3: DATOS DE LAS CURVAS DE AGREGACIÓN 58 PLAQUETARIA, INDUCIDO POR ADP (2 µm). INDICE DE FIGURAS: FIGURA N 1. ESTRUCTURA DE LA β2-glicoproteína I (β2 GPI). 17 FIGURA N 2: REPRESENTACIÓN ESTRUCTURAL DE LA β2 GPI 20 DE PLASMA HUMANA FIGURA N 3: REPRESENTACIÓN ESTRUCTURAL DEL DOMINIO 21 V DE LA PROTEÍNA β2gpi. FIGURA N 4: INTERACCIONES DE LA SUPERFICIE CELULAR DE β2 32 GLICOPROTEÍNA I FIGURA Nº5: MODELO DE RATÓN UTILIZADO EN ENSAYOS 33 5

5 TIPO C57BL/6. FIGURA Nº6: MÉTODO DE INMUNIZACIÓN INTRAPERITONEAL 34 DE RATONES C57BL/6. FIGURA Nº 7: SISTEMA UTILIZADO PARA LA 40 INMUNOTRANSFERENCIA A LA MEMBRANA DE NITROCELULOSA. FIGURA Nº 8: ESQUEMA DISPOSICIÓN CASSETTE DE 41 TRANSFERENCIA. FIGURA Nº 9: GRÁFICO ABSORBANCIAS DE 11 RATONES C57BL/6 46 INUMNIZADOS CON β2gpi (R1 A R11) Y DOS RATONES CONTROLES (C1 Y C2). FIGURA Nº 10: PROMEDIO DE ABSORBANCIAS OBTENIDAS 47 DESDE PLASMA DE RATONES INMUNIZADOS VERSUS PLASMA DE RATONES CONTROLES. FIGURA N 11: GRÁFICO FRACCIONES ELUIDAS DE LA COLUMNA 48 PROTIENA A SEFAROSA V/S ABSORBANCIA DE CADA FRACCIÓN, LEIDAS A 405 nm. FIGURA N 12: GRÁFICO FRACCIONES ELUIDAS DE LA COLUMNA 50 DE AFNIDAD DE BROMURO DE CIANOGENO V/S ABSORBANCIA DE CADA FRACCIÓN, LEIDAS A 405nm. FIGURA N 13: GRÁFICO FRACCIONES CONCENTRADAS DE LA 51 COLUMNA DE AFNIDAD DE BROMURO DE CIANOGENO V/S 6

6 ABSORBANCIA DE CADA CONCENTRADO, LEIDAS A 405nm. FIGURA Nº 14: MEMBRANA DE NITROCELULOSA TEÑIDA CON 52 ROJO PONCEAU 0,1% A PARTIR DE GEL DE ELECTROFORESIS EN POLIACRILAMIDA. FIGURA Nº 15: GEL DE ELECTROFORESIS EN POLIACRILAMIDA 53 TEÑIDO CON AZUL DE COOMASIE G250 LUEGO DE LA TRANSFERENCIA A MEMBRANA DE NITROCELULOSA. FIGURA Nº 16: REVELADO DE WESTERN BLOT. 53 FIGURA N 17: AGREGACIÓN PLAQUETARIA DE LOS 54 (SUERO FISIOLÓGICO 0,9%) ADP 2µM. FIGURA N 18: CONTROLES AGREGACIÓN PLAQUETARIA, 54 CONTROL NEGATIVO, (SUERO FISIOLÓGICO 0,9%) ADP 8 µm. FIGURA N 19: AGREGACIÓN PLAQUETARIA DE LOS 55 (SUERO FISIOLÓGICO 0,9%) ADP 2 µm. FIGURA N 20: AGREGACIÓN PLAQUETARIA DE LOS 55 ANTICUERPOS ANTI β2 GPI, PREINCUBADOS CON ÁCIDO FERÚLICO, CONTROL NEGATIVO, (SUERO FISIOLÓGICO 0,9%) ADP 2 µm. 7

7 FIGURA N 21: AGREGACIÓN PLAQUETARIA DE LOS 56 PREINCUBADOS CON ÁCIDO P-CUMARÍNICO (SUERO FISIOLÓGICO 0,9%) ADP 2 µm. FIGURA N 22: AGREGACIÓN PLAQUETARIA DE LOS 57 PREINCUBADOS CON ADENOSINA (SUERO FISIOLÓGICO 0,9%) ADP 2 µm. FIGURA N 23 AGREGACIÓN PLAQUETARIA DE LOS 57 ANTICUERPOS ANTI β2 GPI, PREINCUBADOS CON ÁCIDO CAFEICO, CONTROL NEGATIVO, (SUERO FISIOLÓGICO 0,9%) ADP 2 µm. 8