Purificación de Proteínas Parte II

Transcripción

1 Purificación de Proteínas Parte II

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4 Fase I. Obtención del extracto crudo Lisis celular. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura. Destrucción mécanica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).

5 Fase I. Obtención del extracto crudo Lisis celular. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura. Destrucción mécanica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).

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7 Fase II. Precipitación con sulfato de amonio Remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus.

8 Fase II. Precipitación con sulfato de amonio Remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus.

9 Fase III. Obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos Cromatografía de exclusión molecular Intercambio iónico Afinidad.

10 Cromatografía La cromatografía es un método de separación para la caracterización de mezclas complejas. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna. Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columna Longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna. 'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio iónico o de afinidad, el volumen de solvente más proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella. Correspondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente que contiene las proteínas no afines al ligando.

11 Cromatografía de exclusión molecular Las moléculas pequeñas penetran en los poros de la matriz (gel), donde la velocidad de flujo es menor Las moléculas grandes, incapaces de penetrar en los poros pequeños de las moléculas de la matriz se mueven entre ellas donde la velocidad de flujo de la fase móvil es superior y por tanto, las moléculas de mayor peso molecular son eluídas primero Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido.

12 Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar. Los geles utilizados como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional. Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. En esta práctica se utilizará el gel dextrano. El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro, proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y daltons. Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua del gel multiplicada por 10

13 Cromatografía de intercambio iónico

14 Intercambio aniónico Fase estacionaria cargada positivamente Intercambio catiónico Fase estacionaria cargada negativamente Estos grupos cargados normalmente están neutralizados por iones del tampón. Estos iones son reversiblemente reemplazados por las proteínas con más tendencia a unirse al soporte. Las proteínas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catiónicos o aniónicos dependiendo de su carga neta. Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. La afinidad con la que una proteína se une a un intercambiador iónico depende de la fuerza iónica del medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la proteína y los iones de la fase móvil. Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza iónica de la fase móvil (aumentando la concentración de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las proteínas mas débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas.

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18 Cromatografía de Afinidad

19 Es esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se le conoce como ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. una cromatografía que utiliza la alta especificidad de las reacciones biológicas del tipo antígenoanticuerpo, hormona-receptor Cuando la muestra atraviese la columna solo se retendrá la sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando.una vez concluida la separación hay que provocar la salida de la sustancia que dio la reacción específica.

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23 Métodos de elución Elución bioespecífica. La fase móvil contiene un modificador, que es un ligando de bajo peso molecular, capaz de desplazar a la macromolécula del sitio activo de la FE. Elución bioespecíficanormal. Interacción inhibidor-muestra Elución bioespecíficainversa. Interacción inhibidor-ligando de afinidad. Elución no específica. La fase móvil provoca la desnaturalización de la muestra, del ligando de afinidad o de los dos.