Análisis Instrumental FCEyN

Transcripción

1 Análisis Instrumental FCEyN Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) Alejandro Leciñana 2017

2 HPLC Es la más versátil y la más utilizada de todas las distintas formas de cromatografía de elución. Si recordamos la ecuación de van Deemter Los términos A (caminos múltiples) y C s u (equilibrio entre las fases) mejoran con partículas más finas.

3 Para aumentar los platos teóricos de una columna de elución, necesito utilizar partículas más y más finas Y por lo tanto necesito más y más presión

4 Y de esta forma llego a un HPLC

5 HPLC desafíos tecnológicos La fase móvil es un líquido (la difusión es mucho más lenta que en gases). El mínimo de la ecuación de van Deemter se alcanza a velocidades de flujo muy pequeñas como para observarlo. La única opción es disminuir el tamaño de las partículas

6 HPLC desafíos tecnológicos Las columnas están empaquetadas con una fase estacionaria muy fina (3 a 10 um), que obliga a usar altas presiones. Para alcanzar velocidades de flujo razonables, es necesario contar con bombas que generen presiones de varios cientos de atmósferas, en forma continua y no pulsada, y las tuberías que soporten estas presiones.

7 Tipos de cromatografías líquidas

8 Diagrama de bloques

9 Componentes comunes Válvulas de inyección Bombas Sistemas de detección Partes diferenciadas Reservorios de fase móvil y tratamiento de solventes Columnas Otros accesorios

10 Válvula de inyección Cargo la muestra a baja presión y la eluyo a alta presión Se pueden intercambiar para volúmenes entre 1 y 100 ul. Repetitividad mejor al 1% en cantidad de muestra inyectada.

11 Bomba de émbolo vaivén (reciprocating pump) Es necesario: Generar muy alta presión (6000 psi; ~400 atm), sin pulsaciones. Velocidades de flujo entre 0,1 y 10 ml/min (reprod mejor al 0.5% rel.) Resistencia a la corrosión de solventes y muestras. Los equipos comerciales incluyen dispositivos que modifican la velocidad del motor de la bomba cuando detectan que se modifica la caída de presión, para mantener constante la velocidad de flujo. Para determinaciones con baja incertidumbre necesito: Exactitud de la velocidad de flujo ±1% Precisión en la velocidad de flujo ± 0.1% El ruido de los pulsos de la bomba debe ser inferior al ruido total del detector (considerando todas las fuentes)

12 Bomba de émbolo vaivén (reciprocating pump) De pistón simple (aproximadamente en el 60% de los equipos) De doble pistón Puede proveer volúmenes de pocos ul hasta 10 ml/min

13 Solventes De alta pureza (calidad HPLC es una de las más puras). Las impurezas generan señal de fondo y dañan la columna. Se utiliza, antes de la bomba, un filtro de 10 um y además una precolumna del mismo tipo, más corta y que prolonga la vida de la columna principal. Los gases disueltos y el polvo se remueven por dispositivos de burbujeo de un gas inerte (que no se disuelve en el solvente). Evito flujo irreproducible ensanchamiento de las bandas disminución del rendimiento del detector

14 Los aire disuelto es un problema significativo en mezclas metanol- agua. Solventes

15 Columnas En general de acero inoxidable, también de vidrio o polímeros especiales. Costo: 200 a 1000 US$. L= 5 a 25 cm diámetro = 3 a 5 mm Tamaño de partícula del relleno, entre 3 y 10 micrones con distribución de tamaño muy estrecha a platos teóricos/m Precolumnas Columnas scavenger : saturan la fase móvil de sílica Columnas guard : columnas más cortas con la misma fase estacionaria que la columna analítica, para prevenir la contaminación de ésta con compuestos altamente retenidos y material particulado. Relleno Partículas porosas de sílica (la más frecuente), alúmina o polímeros de poliestireno-divinilbenceno, que pueden estar cubiertas por un film de solvente orgánico.

16 Qué columna usar?

17 Qué columna usar?

18 Cromatografía de partición Es la más utilizada, y en particular la de fase líquida unida (la fase estacionaria está unida químicamente a la fase fija). Formación del organoxiloxano, a partir de un organo cloro xilano: R: cadena lineal de grupos octil u octildecil. También se pueden unir grupos aminas alifáticas, éteres, nitrilos e hidrocarburos aromáticos (obtengo gran variedad de polaridades de la fase estacionaria). Regla: Polaridad de la fase estacionaria coincidente con la de los analitos, y la fase móvil de muy diferente polaridad.

19 Fase normal y fase reversa Cromatografía en fase normal (la más antigua) fase estacionaria altamente polar (trietilenglicol o agua) y fase móvil poco polar (hexano o propil eter). Cromatografía en fase reversa (la más utilizada) fase estacionaria generalmente un hidrocarburo (pe octilxiloxano) y fase móvi polar (agua, metanol, acetontrilo o tetrahidrofurano). Los compuestos más polares eluyen primero y al aumentar la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución. Cromatografía de par iónico Es una subcategoría de fase reversa que permite separar especies fácilmente ionizables. Se agrega a la fase móvil una sal orgánica que contiene un contraion orgánico grande (amonio cuaternario o alquilsulfonato). Permite la separación de compuestos iónicos y noiónicos presentes en una muestra.

20 Cromatografía de par iónico

21 Solventes - poder de elusión Serie eluotrópica en cromatografia en fase directa de alúmina o sílica

22 Fase reversa El ph no debe ser mayor a 7.5 porque se destruye la columna

23 Fuerza eluotrópica en fase reversa S mezcla = V a S a + V b S b +...

24 Gradientes de solventes Se utilizan dos o más bombas y se mezclan solventes en distintas proporciones, que debo garantizar que sean constantes. En general se comienza con un solvente que eluye poco, y las substancias más afines por el solvente salen rápido. Luego las substancias más afines por la fase estacionaria se van eluyendo al aumentar la fuerza de elución de la mezcla con un gradiente.

25 Gradientes de solventes El programador de solventes a baja presión es más económico, y por lo tanto más utilizado, pero sacrifico repetitividad. En el programador a alta presión es crucial el diseño del manifold de mezclado.

26 Válvulas antiretorno Actúan por el flujo de la fase móvil y no por gravedad. El cierre no es perfecto, pero sí suficiente. Es necesario limpiarlas periódicamente por pasaje de solventes.

27 Aplicaciones

28 Detectores en cromatografía líquida Detector ideal (al igual que en CG) Sensibilidad adecuada (10-8 a g soluto/s) Buena estabilidad y reproducibilidad Respuesta lineal de varios ordenes de magnitud Intervalo de temperaturas de 25 o C a 400 o C (ahora no es necesario rio) Mínimo tiempo de respuesta independiente de la velocidad de flujo Fácil de usar y resistente a trato inadecuado Respuesta similar a cada grupo de solutos Que no destruya la muestra Volumen interno pequeño (volumen muerto)

29 Detectores en cromatografía líquida

30 Detector de absorbancia (el más utilizado) La celda tiene muy pequeño volumen y paso óptico normal. Líneas típicas: 254 y 280 nm de lámpara de Hg También se pueden utilizar espectros a lo largo de la elusión, tomados con espectrofotómetro de matriz de diodos.

31 Detector de fluorescencia muy selectivo y sensitivo Para los compuestos de alta fluorescencia, el límite de detección es unas 100 veces menor que en los detectores de absorbancia.

32 Detector de fluorescencia

33 Detector de índice de refracción (el más universal)

34 Detectores electroquímicos

35 Ruido en los detectores En general es ruido electrónico y se elimina con un filtro Debido a variaciones en la velocidad de flujo, o la presión o la temperatura en la celda del detector Debido a cambios en la concentración de la fase móvil o la velocidad de flujo

36 Comparación de detectores

37 Columnas de exclusión molecular o cromatografía de geles Se aplica a especies de alto peso molecular. Se trata de columnas que contienen partículas nanoporosas de sílica de 5 a 10 micrones, o de polímeros, que atrapan a las moléculas pequeñas en los poros, y en los que las moléculas grandes no entran. En un intervalo intermedio de tamaño, las moléculas pasan tiempos estadísticamente diferentes dentro de la fase sólida. El fraccionamiento está directamente relacionado al tamaño molecular y en parte a la forma. No hay interacciones ni físicas ni químicas entre el soluto y la fase estacionaria. Puedo separar moléculas de masa molecular de hasta dos o más órdenes de magnitud. Filtración por geles: fase estacionaria hidrofílica Permeación por geles: fase estacionaria hidrófóbica

38 Columnas de exclusión molecular

39 Columnas de exclusión molecular La sílica es más rígida, soporta mayor presión y temperatura. Los polímeros pueden sintetizarse de diversas propiedades y tamaño de poro en hasta 5 órdenes de magnitud.

40 Cromatografía de intercambio iónico Los cationes o aniones de la fase móvil presentan diferente afinidad por el relleno de la columna, que es una resina de intercambio iónico, permitiendo así la separación cromatográfica.

41 Cromatografía iónica Columnas con baja capacidad de intercambio Fases móviles con baja fuerza iónica, que permiten suprimirla después, para poder utilizar la detección conductimétrica. columna de intercambio aniónico ms

42 Detectores para cromatografía iónica Conductividad (el más usado) Para aniones o cationes de ácidos o bases moderadamente fuertes Amperometría (electrodo inerte) Aniones/cationes que puedan oxidarse/reducirse Absorciometría Metales pesados con reactivos cromóforos. Silicatos y fosfatos por reacción con molibdato. Alcalino-térreos con Arsenazo I Fluorescencia Amonio, aminoácidos, poliaminas por reacción con ortoftaldehído.

43 Selectividad a diversos iones

44 Columnas supresoras (para detección conductimétrica) columna de intercambio aniónico ms columna supresora (catiónica) ms

45 Columnas supresoras (para detección conductimétrica) Conductor conductimétrico Universal para especies cargadas y con alta sensibilidad Fácil de operar y bajo costo. Puede miniaturizarse. Para columnas analíticas catiónicas Para columnas analíticas aniónicas Deben regenerarse periódicamente. Pueden utilizarse también micromembranas

46 Solventes de elusión

47 Aplicaciones de la cromatografía iónica Iones inorgánicos, con columna supresora y detector conductimétrico

48 El mejor detector de todos el espectrómetro de masas. Los espectrómetros de masa permiten determinar la masa exacta de las moléculas y por lo tanto su identidad química. Precisan un alto vacío para que las moléculas puedan volar libremente sin chocar, ya que en eso se basa la separación por masa molecular. cómo conectar un HPLC, cuya salida es un líquido a temperatura y presión ambientes con un sistema de ultraalto vacío?

49 Electrospray

50 Electrospray

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