COMPLEMENTO TEORICO. CROMATOGRAFIAS ESPECIALES

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA KM 4, 9000, COMODORO RIVADAVIA PATAGONIA SAN JUAN BOSCO CHUBUT, ARGENTINA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES TEL/FAX: ( ) CARRERA DE FARMACIA CATEDRA DE FARMACOGNOSIA COMPLEMENTO TEORICO. CROMATOGRAFIAS ESPECIALES CROMATOGRAFIA PLANAR CENTRIFUGA Utiliza un flujo de Fase Móvil (FM) acelerado por la acción de la fuerza centrífuga. En el transcurso del tiempo, se han ido perfeccionando los equipos en cuanto a la practicidad de su utilización y a los resultados que permiten obtener. 1- Cromatografía centrífuga en papel. En 1955 consistía en un rotor con dos platos conteniendo en el medio una lámina de papel para cromatografía circular. Utilizaba rotores horizontales, por lo que la colección de las muestras eluidas era difícil. 2- Cromatofuga. Consistía en una especie de columna horizontal cilíndrica rellena de material adsorbente (óxido de aluminio, BaCO 3 ). La colección de las fracciones eluidas era dificultosa, causando remezclas. Se utilizó para separar sustancias tales como xantinas, amino ácidos, hasta en cantidades de gramos. 3- Cromatografía en capa fina o delgada centrífuga. Surgieron dos equipos comerciales, siendo el segundo el de mayor aplicación: 3.1- Hitachi CLC-Centrifugal Chromatography, de origen japonés. En este caso, el adsorbente se mezcla con el eluyente y se introduce en un espacio ubicado entre 2 láminas horizontales de 30 cm de diámetro. El exceso de eluyente se remueve por acción de la fuerza centrífuga y a continuación se introduce la muestra en la parte central. La FM se deja gotear en el lugar de siembra generando una separación de las sustancias en bandas concéntricas acelerada por la acción de la fuerza centrífuga merced a un rotor. El espesor de la capa fina puede ser variado, permitiendo trabajar a pequeñas y grandes escalas. La disposición del rotor hace dificultosa la colección de las fracciones separadas Chromatotron, de origen estadounidense. Se utiliza principalmente para realizar cromatografía de tipo preparativa, radial, de capa fina (TLC), en donde la FM es obligada a eluir con una aceleración dada por la fuerza centrífuga aplicada (generalmente de 800 r.p.m.), alcanzando un flujo de 1-10 ml/min. Las dimensiones generales del equipo son 30 x 35 x 30 cm. La diferencia con los anteriores es que el rotor se halla inclinado, lo cual favorece la colección de los eluidos. Principios de la operación: la muestra se aplica en solución, en el centro del disco o plato circular de vidrio que posee la FE sorbida en forma de capa fina. La elución se realiza mediante el solvente que se aplica en el centro, definiendo bandas circulares correspondientes a los componentes que se van separando a medida que el sistema gira mediante el rotor inclinado. Las pérdidas de eluido por los bordes se evitan por un cuello de cinta gruesa engomada que rodea la circunferencia del plato. Complemento Teórico Unidad 2. Cromatografías especiales - Dra. María Luján Flores

2 El rotor está guardado en una cámara, cubierto por un plato de cuarzo o de otro material que permite la observación del desarrollo al UV, dejando entrever las zonas de separación de las sustancias. A través de la cámara pasa un flujo constante de N 2 para prevenir la condensación del eluente y la oxidación de la muestra. Capacidad: en general se pueden separar de 50 hasta 500 mg de muestra, utilizando una capa fina de 2 mm de espesor. Posee menor resolución que un HPLC, pero a diferencia de una TLC planar, en este tipo de cromatografía el producto es eluido y por lo tanto se evita el tener que raspar la capa fina para obtener las sustancias separadas. FE: sílica gel, alúmina o sílica gel nitrato de plata. No se utiliza en general para FR. FM (solventes): es compatible con todos los solventes usados habitualmente en cromatografía, incluyendo ácido acético. No se deben usar ácidos minerales. Ventajas: - Permite variar la FM y el gradiente de elusión. La atmósfera de N 2 previene oxidaciones de los compuestos. - Separaciones rápidas, aproximadamente en min. - Permite observar las zonas de separación durante el desarrollo con una lámpara UV o al visible. - Las sustancias separadas eluyen fácilmente debido a la inclinación del rotor. - Puede utilizarse un espesor de capa fina de 1, 2, 4 o 8 mm, aumentando la capacidad del sistema. Además el adsorbente puede regenerarse in situ para su reutilización. - Utiliza un equipo compacto, de fácil transporte y de menor precio que un HPLC. Ejemplo: la separación de estricnina y brucina (250 mg) sobre una capa fina de sílica gel de 2 mm de espesor, se observa con muy buena resolución mediante las bandas concéntricas más abajo indicadas. El revelado se realiza con lámpara UV. Complemento Teórico Unidad 2. Cromatografías especiales - Dra. María Luján Flores

3 CROMATOGRAFIA LIQUIDA EN COLUMNAS 1- Convencional de laboratorio a presión hidrostática (presión normal). Las partículas de la FE poseen en general un diámetro de µm. El uso principal es como cromatografía preparativa y la mayor desventaja es el tiempo que demanda el desarrollo. - Soporte: cilindro de vidrio o metal o plástico, en todos los casos es un soporte inactivo o inerte. La relación óptima de longitud d.i. es de 8:1. - FE: sólida, constituida por un adsorbente polar (sílicagel, alúmina, ambos como tal en el caso de las cromatografías comunes o con la polaridad aún más aumentada por ej. por grupos nitrilos o aminos, para FN) o de menor polaridad (C18, C8, para cromatografías en FR); también pueden ser resinas de intercambio aniónico o catiónico, geles para cromatografía por filtración, material para cromatografía de afinidad o partículas de celulosa microcristalina para partición. - FM: líquida, la cual se puede variar ampliamente durante el desarrollo, siempre en forma gradual. En el caso de las cromatografías comunes y de aquellas en FN, la FM se debe variar de menor a mayor polaridad; en el caso de FR, se varía de mayor a menor polaridad. - Proceso: dependerá de la FE, pudiendo ser de adsorción, intercambio iónico, filtración, afinidad, partición. - Empacado: puede ser en seco (ya sea directamente en la columna vacía o en la columna llenada previamente con la primera FM a usar), o FE en suspensión (en la primera FM a usar). - Siembra: muestra disuelta o suspendida en un solvente + el doble de peso del adsorbente, formando una pastilla que al evaporarse el solvente, contendrá el polvo de adsorbente con la muestra sobre su superficie. - Desarrollo: en general descendente. - Detección: las sustancias separadas se obtienen a la salida de la columna, de tal forma que la detección se realizará sobre las fracciones eluidas. Puede realizarse por métodos físicos (luz natural o UV), o químicos, o sembrando las distintas fracciones en un sistema de TLC y revelando allí. - Factores que afectan la separación: grado de activación del adsorbente para el caso de adsorción; granulometría de la FE o viscosidad del gel cuando corresponda, homogeneidad del empacado, inercia química de la FE y de la FM. La velocidad de elusión ideal es de 2 ml / min; la relación entre largo y d.i. de la columna de 8:1; la temperatura deberá ser constante y homogénea en toda la columna durante todo el proceso ya que afecta la volatilidad y solubilidad de las sustancias. La humedad y presión son las normales del ambiente. 2- Instrumental: HPLC, CG, FSC. Ver el material correspondiente entregado como Complemento Teórico y lo que se desarrolle en los grupos de metabolitos de mayor aplicación en cada caso. 3- Cromatografía en Columnas especiales. Dado los largos tiempos de desarrollo de las cromatografías líquidas en columnas convencionales y por otro lado, los costos elevados del equipamiento requerido para las instrumentales, se buscaron otros sistemas que no siendo tan costosos, ofrecieran alguna ventaja sobre las columnas convencionales. Surgieron así las llamadas COLUMNAS ESPECIALES. Complemento Teórico Unidad 2. Cromatografías especiales - Dra. María Luján Flores

4 3.1- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA SECA. Es semejante a una TLC, sólo que se realiza en columnas en general de material plástico o nylon, que permiten ser cortadas en las bandas en que se separan las sustancias. Se empacan en seco. La muestra se siembra también en seco, recubierta o mezclada con el adsorbente en una proporción de muestra / adsorbente de 1:100. En algunos casos se siembra la muestra apenas humectada con la FM. A continuación se deja que la FM avance por capilaridad o simple humectación hasta que llega al final de la columna. Las sustancias se separarán en bandas y luego se procederá a cortar las partes de la columna que contengan cada banda. Permite mejor resolución y reproducibilidad. - Soporte: inactivo. Columna plástica o de nylon, tubo fácil de cortar o extruir y que puede verse al UV. En general de longitud importante y de d.i. pequeño (10:1; 25:1). - Principio: una TLC ofrece mayor resolución que la columna para una misma FE y FM y menor tiempo de desarrollo; pero la columna permite variar la FM. Por ello esta columna especial combina las ventajas características de una TLC con las de una columna. - FE: en general adsorbente sílicagel 60 F 254 ( µm) con 40 % de humedad (grado de actividad III). Se empaca en seco. La relación adsorbente muestra varía de 40:1 hasta 300:1. - FM: el solvente en cada plato teórico que se genera, va encontrando material seco. La muestra se incorpora en la solución o suspensión de FM (o seca en algunos casos) y se eluye por humectación con la FM que avanza hasta llegar al final de la columna. - Muestra: seca o recubierta o mezclada con el adsorbente o bien apenas humectada con la FM; hasta 500 mg en general. - Proceso: temperatura y humedad ambiente. Presión en general normal, pero puede combinarse con vacío para acelerar el proceso. En general, el tiempo de desarrollo es de 30 min. - Revelado: pueden observarse las bandas correspondientes a las sustancias que se van separando, mediante luz natural o con luz UV. Ello permite cortar las zonas separadas y luego fluir de la FE con solventes apropiados CROMATOGRAFIA EN COLUMNA BAJO VACIO. Básicamente se aplica una succión a la base de la columna para forzar el flujo de la FM a través de una columna empacada con FE para TLC. Si se pretendiera utilizar FE para TLC en columna, el proceso sería extremadamente lento, pero optimizaría la separación, por ello una estrategia es utilizar esta FE forzando el flujo de FM merced a la aplicación de vacío. En general las columnas son de poca longitud, pero de mayor diámetro (columnas cortas, pero anchas). - Soporte: inactivo. Columna de vidrio, semejante a un embudo separador, en general de longitud baja y de d.i. grande (5:1). - Principio: se utiliza vacío (aproximadamente de 25 mm de Hg) para acelerar el flujo de la FM, por lo que el tiempo de desarrollo se limita a 2 3 h como máximo. - FE: en general adsorbente grado TLC (10-40 µm), por lo que bajo vacío logra la máxima densidad. Se empaca en seco, luego se aplica solvente de mediana o baja polaridad, se aspira a seco con vacío y estará lista para sembrar la muestra e iniciar el proceso cromatográfico. La relación adsorbente muestra está alrededor de 50:1 o menos. - FM: el solvente debe ser de punto de ebullición medio y poco viscoso para evitar pérdidas por evaporaciones ligeras o un entorpecimiento del proceso por la viscosidad. Complemento Teórico Unidad 2. Cromatografías especiales - Dra. María Luján Flores

5 - Muestra: seca o recubierta o mezclada con el adsorbente o disuelta o suspendida en un pequeño volumen de la FM. - Proceso: temperatura y humedad ambiente. Presión de aproximadamente 25 mm de Hg, es decir reducida a condiciones de vacío. En general, el tiempo de desarrollo es de 2-3 h. - Revelado: como en las columnas convencionales CROMATOGRAFIA EN COLUMNA CON PRESION. Según la presión por encima de la normal que se emplee, se clasifica en: FLASH CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA DE PRESION BAJA (LOW PRESSURE CROMATOGRAFIA DE PRESION MEDIA (MEDIUM PRESSURE CROMATOGRAFIA DE ALTA PRESION (HIGH PRESSURE La tabla siguiente destaca los principales parámetros que definen cada una de ellas, en comparación con la columna convencional o común de laboratorio (open column). En todos los casos se logra optimizar el proceso aumentando el flujo merced a un aumento de la presión aplicada. Ello permite trabajar con menor cantidad de muestra, con partículas de tamaño muy pequeño (lo cual genera un consecuente aumento de la resolución), con columnas pequeñas y un flujo mayor, lo que a presión normal no sería posible. En flash cromatografía se aplica presión a partir de un cilindro de N 2 o de aire de calidad para cromatografía. Las columnas son de vidrio, con longitudes en general que varían entre los 7 y los 15 cm y d.i. entre 3 y 7 cm. Complemento Teórico Unidad 2. Cromatografías especiales - Dra. María Luján Flores