UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR BAHIA BLANCA - ARGENTINA

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1 PROGRAMA DE: BIOANALÍTICA B CODIGO : TEORICAS HORAS CLASE PRACTICAS PROFESOR RESPONSABLE P/SEMANA P/ CUATRIM. P/SEMANA P/CUATRIME BQCO. GUSTAVO H. LOPEZ ASIGNATURAS CORRELATIVAS PRECEDENTES APROBADAS CURSADAS BIOLOGÍA DE VIRUS Y PROCARIOTAS OBJETIVOS Y DESCRIPCION DE LA MATERIA: El objetivo de esta materia es capacitar al alumno en la aplicación y el empleo de métodos de laboratorio para determinar la composición de muestras biológicas y/o diagramar ensayos experimentales. Esta materia consta de tres unidades principales. En la unidad I se desarrollan los conocimientos relacionados con el diseño de ensayos experimentales para el estudio metabólico, ensayos in vivo e in vitro, aislamiento de células a partir de un tejido y cultivos celulares. En la unidad II se describen las herramientas utilizadas para el monitoreo de biomoléculas, métodos inmunológicos, electrofisiológicos y trazadores radioactivos. En la unidad III se exponen los fundamentos teóricos de los métodos utilizados en la actualidad para el aislamiento, purificación, detección y cuantificación de las biomoléculas. En los trabajos prácticos se introduce al alumno en las distintas metodologías relacionadas con el manejo de materiales y equipamiento de uso corriente en el laboratorio. Un objetivo más ambicioso lo constituye la iniciación en otras metodologías mas sofisticadas como por ejemplo la Cromatografía Gaseosa acoplada a un Detector Selectivo de Masas (GC-MS). Además se entrena al alumno para que compruebe visualmente la relación entre las propiedades fisicoquímicas de las moléculas y las condiciones del ensayo y para que comprenda cómo esta relación condiciona la selección del método. En resumen, la meta principal que se persigue en esta materia es formar en el alumno un sentido crítico frente a un problema específico, que lo ayude a seleccionar la metodología más apropiada en función de la composición y características de la muestra en estudio.

2 METODOLOGIA DE ENSEÑANZA El estudio de la materia se abordará principalmente desde tres aspectos: 2 Clases teóricas: se exponen y explican los fundamentos básicos del funcionamiento de las distintas metodologías, haciendo hincapié en los alcances y limitaciones de las mismas. Trabajos prácticos de laboratorio: se aplican técnicas de uso común en los laboratorios de clínica, investigación e industria. A través de la utilización de muestras biológicas en los protocolos de trabajo se entrena a los alumnos en los cuidados y consideraciones para la manipulación de las mismas, además se los introduce en el manejo de material y equipamiento de laboratorio Clases de discusión de problemas: Se proponen problemas reales que ayudan al alumno a plantear y comprobar hipótesis, diseñar experimentos y aplicar las técnicas desarrolladas en la teoría. El docente cumple el rol muy importante de moderador y orientador de la discusión. METODOLOGIA DE EVALUACION Régimen para el cursado de la materia 1. Antes de cada trabajo práctico se rendien cuestionarios escritos sobre los temas relacionados 2. Se toman dos parciales escritos, los cuales son aprobados con el 60%. Los desaprobados tienen la opción a su correspondiente complementario. 3. La asistencia a los trabajos prácticos, a su explicación y a la discusión de problemas es de carácter obligatorio. 4. Podrán tener 2 faltas antes de cada parcial, de las cuales solo una podrá ser a trabajos prácticos o explicación. Los cuestionarios desaprobados se consideran como una falta al práctico correspondiente. Régimen para aprobar la materia: 1. Examen de promoción Se consideran requisitos indispensables: Calificaciones iguales o superiores a 80 puntos en ambos parciales. Los parciales desaprobados pierden el régimen de promoción Luego del segundo parcial se debe rendir un examen integrador que puede ser escrito u oral, se aprueba con una nota igual o mayor al 60%. La nota final resulta del promedio de ambos exámenes de promoción y del integrador Para rendir el examen integrador el alumno debe contar con las correlativas fuertes de la materia, aprobadas, es decir debe estar en condiciones de rendir el examen final de la materia. 2. Examen Final Los alumnos que no hayan aprobado la promoción deben rendir un examen final, este se aprueba con una nota igual o mayor al 60%. podrá ser escrito u oral.

3 PROGRAMA TEORICO SINTETICO 1. UNIDAD I: Modelos para estudios metabólicos Aislamiento de células a partir de un tejido. Separación de los distintos tipos celulares Cultivo celular. Estudios in vivo e in vitro. Citoquímica e Histoquímica UNIDAD II: Métodos para el monitoreo de biomoléculas Empleo de isótopos radioactivos como trazadores de moléculas celulares. Métodos inmunológicos. Electrofisiología celular. Sondas intracelulares. Indicadores fluorescentes y luminiscentes Métodos para la introducción de moléculas en el interior celular Técnicas para el estudio de membranas 3. UNIDAD III: Métodos para el aislamiento y purificación de biomoléculas Preparaciones de muestras biológicas. Métodos de separación y propiedades físicas de las biomoléculas. Purificación de biomoléculas mediante métodos cromatográficos. Parámetros a tener en cuenta en la elección de un método cromatográfico. Diseño de un protocolo de purificación. Preparación de la muestra. Definición de cromatografía y descripción de los métodos. Cromatografía de reparto. Cromatografía de adsorción. Cromatografía de intercambio iónico. Cromatografía en columnas hidrofóbicas. Cromatografía en gel o exclusión molecular. Cromatografía de afinidad. Cromatografía gaseosa de reparto gas-líquido (GLC) y en fase sólida (GSC). Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) Cromatografía líquida de baja presión (FPLC). Electroforesis. Electroforesis en papel. Electroforesis en acetato de celulosa. Electroforesis en gel. Isoelectroenfoque. Electroforesis bidimensional. Inmunoelectroforesis. Transferencia (blotting). Electroforesis capilar. Filtración. Distintos tipos de filtros. Filtración molecular, diálisis

4 PROGRAMA TEORICO ANALITCO 1. UNIDAD I: Modelos para estudios metabólicos 1.1. Aislamiento de células a partir de un tejido Separación de los distintos tipos celulares 1.3. Cultivo celular Aplicaciones Ventajas y desventajas Definición de los distintos tipos de cultivo celular Cultivo de órganos Explantes Cultivos celulares Cultivos primarios Líneas celulares Líneas celulares continuas Medios de cultivo Factores de crecimiento Equipamiento y materiales utilizados Estudios in vivo e in vitro Ventajas y desventajas Aplicaciones Citoquímica e Histoquímica Métodos de detección de Lípidos Métodos de detección de Hidratos de Carbono Métodos de detección de Ácidos Nucleicos Métodos de detección de Proteínas 2. UNIDAD II: Métodos para el monitoreo de biomoléculas 2.1. Empleo de isótopos radioactivos como trazadores de moléculas celulares Precursores Actividad específica Tipos de emisores y sus aplicaciones Ensayos cuantitativos Seguimiento de ensayos metabólicos Métodos inmunológicos Anticuerpos como herramientas específicas Anticuerpos policlonales y monoclonales Uso de los anticuerpos en las técnicas bioquímicas Radioinmunoensayo (RIA) RIA de fase sólida RIA de inhibición competitiva Ventajas y desventajas Ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA) Métodos con anticuerpos fluorescentes Método de inmunofluorescencia directo (IFD) Método de inmunofluorescencia indirecto (IFI) Sistemas de amplificación; avidina - biotina Western Blot Autorradiografía Electroquimioluminiscencia (ECLIA) Electrofisiología celular Medición de la concentración de iones intracelulares Estudio de canales iónicos (Patch Clamp) 4

5 2.4. Sondas intracelulares. Indicadores fluorescentes y luminiscentes Tipos de sondas Histoquímicas Genómicas Green Fluorescent Protein (GFP). Ventajas y Aplicaciones 2.5. Métodos para la introducción de moléculas en el interior celular Métodos de permeación celular Microinyección Liposomas 2.6. Técnicas para el estudio de membranas Liposomas Métodos de preparación Aplicaciones 3. UNIDAD III: Métodos para el aislamiento y purificación de biomoléculas 3.1. Preparaciones de muestras biológicas Lisis celular y extracción 3.2. Métodos de separación y propiedades físicas de las biomoléculas Métodos basados en la polaridad Solubilidad diferencial Precipitación por sales Precipitación por solventes orgánicos Adsorción Métodos basados en la reactividad química diferencial Desnaturalización selectiva Combustión Saponificación Métodos basados en el tamaño Ultracentrifugación Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial Fraccionamiento por centrifugación en gradientes de densidad y flotación Filtración. Diálisis Cromatografía de exclusión Métodos basados en las características iónicas Cromatografía de intercambio iónico Electroforesis Métodos basados en la forma Cromatografía de afinidad Purificación de biomoléculas mediante métodos cromatográficos Parámetros a tener en cuenta en la elección de un método cromatográfico Diseño de un protocolo de purificación Preparación de la muestra Definición de cromatografía y descripción de los métodos Cromatografía de reparto Cromatografía en papel Monodimensional Bidimensional (huellas dactilares) Cromatografía en capa fina Monodimensional Bidimensional 5

6 Cromatografía de adsorción Cromatografía de intercambio iónico Propiedades de las matrices; capacidad total, capacidad aprovechable Elección del intercambiador iónico Aniónico o catiónico Porosidad y tamaño de malla Elección del ph, tampón y condiciones iónicas Estrategias para la elución Cromatografía en columnas hidrofóbicas Cromatografía en gel o exclusión molecular Materiales de las matrices Ventajas Aplicaciones Determinación del peso molecular Cromatografía de afinidad Antígeno-Anticuerpo Enzima-Sustrato Receptor-Ligando Metales quelados Aplicaciones Cromatografía gaseosa de reparto gas-líquido (GLC) y en fase sólida (GSC) Variables involucradas en el proceso cromatográfico Eficiencia de la columna Teoría de la elución (ecuación de Van Deemter) Eficiencia de la fase estacionaria Fuerzas intermoleculares involucradas en la interacción analito-fases Resolución Clasificación de las columnas Columnas empacadas Columnas capilares Tipos de soportes Aspectos a tener en cuenta para la elección de la columna Fase estacionaria Diámetro interno (ID) Longitud Espesor del film de la fase estacionaria Aspectos a tener en cuenta para mejorar la eficiencia de las columnas Gas carrier Velocidad de flujo Temperatura Equipos Tipos de inyectores Purged packed Split/Splitless Cool on-column Tipos de detectores FID: detector de ionización de llama TCD: detector de conductividad térmica ECD: detector de captura electrónica NPD: detector de nitrógeno/fósforo

7 Aplicaciones Cromatografía gaseosa acoplada al detector selectivo de masas. (GC-MS) Fundamentos del funcionamiento del detector selectivo de masas Ventajas sobre otros detectores Aplicaciones Cromatografía líquida Cromatografía líquida moderna vs tradicional Cromatografía líquida vs gaseosa Comparación de las variables involucradas en ambos procesos Características de los compuestos a tener en cuenta para la elección de una u otra técnica Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) Métodos básicos de separación Tipos de fase estacionaria Importancia de la fase móvil Concepto de polaridad y fuerza Elección del solvente; clasificación Tipos de columna Equipos Aplicaciones Cromatografía líquida de baja presión (FPLC) Columnas Equipos Ventajas y desventajas Aplicaciones Electroforesis Electroforesis en papel Electroforesis en acetato de celulosa Electroforesis en gel Electroforesis en gel de agarosa Electroforesis en gel de poliacrilamida Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Isoelectroenfoque Electroforesis bidimensional Inmunoelectroforesis Transferencia (blotting) Aplicaciones Electroforesis capilar (CE) Teoría de la migración Efecto electroendosmótico Tipos de electroforesis capilar Ventajas y aplicaciones 3.5. Filtración Tipos de filtros Filtros de nitrocelulosa Filtros de fibra de vidrio Aplicaciones Filtración molecular. Diálisis

8 8 PROGRAMA DE TRABAJOS PRACTICOS 1. Fraccionamiento de la actividad enzimática mediante la precipitación con sulfato de amonio. Objetivos: Purificar la enzima fosfatasa ácida vegetal mediante el fraccionamiento con sulfato de amonio. Realizar una curva de precipitación con distintas concentraciones de sal. Determinar la concentración óptima de sulfato de amonio para la purificación. Determinar la actividad específica de la enzima mediante una reacción colorimétrica. Manejo de muestras biológicas. 2. Extracción, aislamiento e identificación de los lípidos de distintos tejidos de origen animal y vegetal. Objetivos: Extraer moléculas lipídicas de los tejidos de origen animal y vegetal, mediante métodos de solubilidad diferencial. Aislar e identificar estas moléculas por cromatografía en capa fina (TLC), mono y bidimensional. Observar el efecto de la polaridad de los sistemas de solventes sobre la separación de las distintas clases de lípidos en relación a sus estructuras. 3. Análisis de Residuos y Biomoléculas por Cromatografía Gaseosa Capilar. Objetivos: Introducir al alumno en el manejo de la Cromatografía Gas-Líquido Capilar (GLC). Aplicar la Cromatografía Gaseosa al análisis de moléculas con distinta estructura y propiedades fisicoquímicas. Utilidad del detector de ionización de llama (FID) como detector universal. Calcular y analizar los parámetros básicos cromatográficos, Tiempo de retención (identificación), Eficiencia y Resolución (performance), integración de áreas (cuantificación). Observar el efecto de la temperatura y el cambio de polaridad de la columna analítica sobre la resolución de los analitos. Introducir al alumno en técnicas de extracción, clean-up y derivatización. Utilidad de la espectroscopia de masas (MSD) como técnica confirmatoria. 4. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE). Separación de Proteínas de Cereales. Objetivos: Introducir al alumno en las técnicas básicas de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Evaluar la migración diferencial de las distintas proteínas bajo la influencia de un campo eléctrico. Aplicar técnicas de solubilidad diferencial para la extracción selectiva de un grupo de proteínas de interés. Identificar las distintas variedades de las semillas de cereales comparando los perfiles proteicos obtenidos en los electroferogramas con los patrones correspondientes.

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