Procesos Industriales de Separación

Transcripción

1 Procesos Industriales de Separación Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001) Proceso de bioseparación Definición: Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento de productos sintetizados por procesos biotecnológicos Definición extendida: Etapas de refinamiento final de procesos tales como tratamiento de efluentes y purificación de agua por biotecnología UPSTREAM - formulación de medios - desarrollo de inóculo - esterilización - inoculación FERME TACIÓ DOW STREAM - extracción de producto, purificación y refinamiento - tratamiento de aguas - recuperación de subproducto 1

2 Por qué necesitamos bioseparación? Enriquecimiento del producto objetivo Reducción de volumen Remoción de impurezas específicas Mejoramiento de la estabilidad del producto Alcanzar las especificaciones del producto Prevención de la degradación del producto Prevención de otras catálisis diferentes a las deseadas Prevención de envenenamiento del catalizador Retos en ingeniería de bioseparaciones Bajas concentraciones de producto Gran número de impurezas Termolabilidad de bioproductos Estrecho margen de operación de ph y fuerza iónica Sensibilidad al esfuerzo cortante de bioproductos Baja solubilidad de bioproductos en solventes orgánicos Inestabilidad de bioproductos en solventes orgánicos Estrictos requerimientos de calidad Porcentaje de pureza Ausencia de impurezas específicas Un proceso ideal de bioseparación debe combinar alta capacidad con alta selectividad, y debe asegurar estabilidad del producto Efecto del producto en el proceso de separación aturaleza del producto Calidad requerida (Mercado) Extensión y tipo del proceso de separación 2

3 The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001) Productos biológicos Producto Bebidas alcohólicas: Cerveza, vino, licores Ácidos orgánicos: Ácido acético, ácido cítrico Vitaminas: Vitamina C, vitamina B12, riboflavina Amino ácidos: Lisina, glicina, fenilalanina Antibióticos: Penicilinas, neomicina, bacitracina Carbohidratos: Almidón, azúcares, dextranas Lípidos: Glicerol, grasas, ácidos grasos Naturaleza de requerida la Clarificación, distilación bioseparación Precipitación, filtración, adsorción, extracción con solventes Precipitación, filtración, adsorción, extracción con solventes Precipitación, filtración, adsorción, extracción con solventes Precipitación, filtración, adsorción, extracción con solventes Precipitación, filtración, adsorción Precipitación, filtración, adsorción, extracción con solventes Productos biológicos (cont...) Proteínas: Alimentos y sus aditivos Nutracéuticos Enzimas industriales Hormonas Enzimas farmacéuticas Productos derivados de plasma Anticuerpos monoclonales Factores de crecimiento Trombolíticos Proteínas derivadas de r-dna Proteínas de diagnóstico Vacunas Productos basados en DNA: Pruebas de DNA, plásmidos, nucleótidos, oligonucleótidos Filtración, precipitación, centrifugación, adsorción, cromatografía, separaciones basadas en membranas Filtración, precipitación, centrifugación, adsorción, cromatografía, separaciones basadas en membranas 3

4 Un buen proceso de separación: Asegura la pureza deseada del producto Asegura la estabilidad del producto Mantiene costos bajos Es reproducible Es escalable Cumple con las regulaciones establecidas La economía del proceso está determinada por: Capital invertido Costos de operación Otros factores Eficiencia de las operaciones unitarias individuales Pérdidas en cada etapa Destrucción o degradación del producto durante el proceso Estado físico del producto al final de cada etapa Costo del tratamiento del efluente Correlación entre concentración de producto antes de la purificación y precio de venta 10 5 Agua Etanol Amino ácidos Antibióticos Proteasas microbianas Enzimas Ácido cítrico Amilasas Penicilina Treonina Cefalosporina Gentamicina Renina Enzimas de diagnóstico Ácido giberélico Glucosa oxidasa Anticuerpos monoclonales Insulina Hormona humana de crecimiento Activador plasminógeno de tejido Factor VIIII Vacuna B hepatitis Glicerofosfato deshidrogenasa Luciferasa Enzimas terapéuticas Urokinasa Precio de venta ($/kg) (Knight, 1989) 4

5 Importancia económica de la ingeniería de la bioseparación Costo de bioseparación Producto Precio relativo aproximado Costo del proceso de separación (%) Etanol 1 15 Proteína unicelular Biomasa de levadura 2 20 Ácido cítrico Glutamato monosódico Xantanas Penicilina G Enzimas a granel Proteínas terapéuticas/dna > Importancia de los procesos de separación a diferentes niveles de producción ivel de producción Alto 1 Medio 2 Bajo 3 Fuente m.o. seleccionado m.o. mutados y DNA recomb. m.o. DNA recomb. Pureza requerida Bajo % Mediana a alta % Alta % Eficiencia de recuperación % % 5 50 % Costo recup./costo de producción Costo recup./(costo de producción costo de desarrollo) 1 Ácido cítrico, 300,000 TON/año (1987) 2 Insulina, 1 TON/ año (1987) 3 Interferon, 10-5 TON/año (1987) Estrategias para bioseparación Están disponibles un gran número de métodos de bioseparación La estrategia está basada en como estos métodos pueden ser mejor utilizados para una separación dada Se necesita tomar en cuenta lo siguiente: El volumen de la corriente de proceso La abundancia relativa del producto en esta corriente de proceso El uso que se le intenta dar al producto, esto es, requerimientos de pureza El costo del producto Requerimientos de estabilidad 5

6 Las tecnologías de separación pueden clasificarse de acuerdo a su principio fundamental (Las barras representan el costo relativo de cada proceso) The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001) Proceso de purificación cromatográfica de macromoléculas Pureza Refinamiento Pureza final Captura Purificación intermedia Purificación inicial Estabilización Clarificación Concentración Remoción de: proteínas, ácidos nucléicos, endotoxinas y virus Etapas Selección y combinación de técnicas de purificación Resolución Velocidad Capacidad Recuperación Minimice el manejo de la muestra Minimice el número de etapas Use diferentes técnicas en cada etapa Cada técnica ofrece un balance Entre resolución, capacidad, Velocidad y recuperación 6

7 Propiedades de las técnicas de purificación comúnmente usadas Técnica Propiedad explotada Capacidad Resolución Rendimiento promedio Costo Composición muestra Composición producto Precipitación por Carga Alta Muy baja Medio Bajo >1 mg ml -1 Volumen pequeño ph Concentración alta Precipitación con Hidrofobicidad Alta Muy baja Alto Bajo >1 mg ml -1 I alto (NH4)2SO4 Volumen pequeño Concentración alta Extracción en dos Mezcla Alta Muy baja Alto Bajo Puede Concentración de fases acuosas Bioafinidad Alta Alta Variable Alto contener polímero alta (PEG) sólidos Cromatografía de Carga Media Media Medio Medio I Bajo I alto intercambio iónico ph correcto ph diferente Cromatografía de Hidrofobicidad Media Media Medio Medio I alto I bajo interacción ph diferente hidrofóbica Cromatoenfoque Carga / pi Baja Alta Medio Alto I bajo Presencia de anfolitos Cromatografía de Mezcla Media Alta Medio Medio I bajo afinidad de teñido ph neutral I alto ph diferente Cromatografía de Bioactividad Media-Baja Muy alta Bajo Alto Dependiente Condiciones de afinidad de ligando sobre el desnaturalización ligando potencial Cromatografía de Tamaño Muy baja Baja Alto Medio Volumen bajo Diluido permeación en gel Estrategia convencional: Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento Basado en arreglos lógicos de métodos de bioseparación Las técnicas de baja resolución, alta capacidad (por ejemplo, precipitación, filtración, centrifugación, cristalización) se usan primero para recuperación y aislamiento Las técnicas de alta resolución (por ejemplo, adsorción, cromatografía, electroforesis) son entonces usadas para purificación y aislamiento Métodos de bioseparación Baja resolución alta capacidad Ruptura celular Precipitación Centrifugación Extracción líquido-líquido Percolación Filtración Extracción con fluídos supercríticos Microfiltración Diálisis Alta resolución baja capacidad Ultracentrifugación Adsorción Cromatografía de lecho empacado Separación por afinidad Electroforesis 7

8 Métodos de bioseparación (cont...) Alta resolución-alta capacidad Ultrafiltración Cromatografía de lecho fluidizado Cromatografía de membrana Cromatografía de columna de Monolith Captura Definición: Purificación inicial de la molécula objetivo de un material crudo Meta: Rápido aislamiento, estabilización y concentración Resolución Velocidad Capacidad Recuperación Use una técnica de alta capacidad para reducir el volumen de la muestra Concéntrese en lo robusto y simple de la primera etapa de purificación Purificación intermedia Definición: Nueva remoción de contaminantes Meta: Purificación y concentración Resolución Velocidad Capacidad Recuperación Use diferentes técnicas en cada etapa Minimice el número de etapas 8

9 Refinamiento Definición: Remoción final de contaminantes traza, Ajuste de ph, sales o aditivos para almacenamiento Meta: Producto final de alto nivel de pureza requerido Resolución Velocidad Capacidad Recuperación Use diferentes técnicas en cada etapa Planeando las estrategias de purificación Elección de las técnicas Capacidad (C) Resolución (R) Rendimiento de proteína Costo Ordenando las técnicas Precipitación (alta C y baja R) Intercambio iónico (mediana C y mediana R) Cromatografía de afinidad (mediana/baja C y alta R) Reducción del volumen de operación en cada etapa Sobrenadante Precipitado Precipitación Centrifugación Intercambio iónico Diálisis Reducción del volumen Filtración en gel Secado Enzima en polvo 9

10 The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001) The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001) Producción de celulasas (Ghose y Pathak, 1973) Cultivo sumergido Cultivo sólido (Técnica koji) 10

11 Producción de enzimas Cultivo microbiano Fermentador para siembra Cultivo sumergido Cultivo sólido Extracto crudo Precipitación Adición de estabilizantes Enzima en solución Cromatografía Secado Enzima en polvo Ubicación de las enzimas Enzimas extracelulares Centrifugación o filtración Rompimiento celular Enzimas intracelulares Centrifugación o filtración Precipitación Secado Cromatografía Ultrafiltración Extracción líquido-líquido Estrategia de purificación Producción Calidad Enzima Cantidad Economía 11

12 Preservando la actividad Minimizar La desnaturalización La inactivación La proteólisis Otras precauciones El problema más común es la pérdida de actividad repentina, debida a: Falla del ensayo Composición incorrecta del buffer Impureza de los reactivos Proteólisis Precipitación Presencia de un inhibidor Pérdida de un inhibidor o cofactor Conceptos de purificación de proteínas Factor de purificación Es la relación entre la actividad específica después de una técnica de purificación y la actividad específica en el extracto crudo Rendimiento Es la evaluación de la cantidad de actividad o proteína activa obtenida después de una técnica de purificación. Generalmente es reportada en %. Siendo el 100% la actividad del extracto crudo 12

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