Metodos de purificación

Transcripción

1 Metodos de purificación Basado en las siguientes propiedades proteicas: Tamaño Solubilidad Carga Adsorción Afinidad CAROLINA VITA

2 Característica Tamaño Solubidad Polaridad Carga Procedimientos Dialisis ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifufacion Precipitación con Sales Solventes organicos por ph Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque Selectividad Cromatografia de afinidad

3 Cromatografias de exclusión molecular Separan por tamaño Las columnas rellenas polimeros inertes Insolubles pero muy hidratados Sephadex: polimeros de dextrano Sepharose: agarosa Superose: agarosa entrecruzada Sephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano

4 Exclusión molecular 1.La columna se equilibra con el buffer de corrida 2. Aplicación de la muestra (0.5-5% volumen de columna) 3. Elución..

5 Exclusión molecular 1. Separa mezclas de proteínas por tamaño 2. De macromoléculas culas diferente 3. De grandes estructuras celulares como ribosomas 4. Determinación n de PM

6 Volumen de exclusión Proteínas de gran tamaño o no penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusión n de la columna Vo

7 Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmulaπr 2 x h Kav Determinacion de PM Kav =Ve-Vo / Vt-Vo Log Mw

8 CARGA Los grupos R en las proteínas globulares se encuentran sobre la superficie exterior de la molécula, aunque también pueden tener grupos ocultos o participando de puentes de H Carga depende de las propiedades ácido base de los grupos R

9 Cromatografía a de intercambio iónicoi Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente. Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil (contraiones), estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz. La matriz generalmente es un compuesto inorgánico, resinas sintéticas o polisacáridos. Matriz Nombre Dextrano Agarosa Celulosa Sephadex Sepharose CL-6B Sephacel

10 Grupos cargados Son una propiedad fundamental del intercambiador. Determina el tipo y la fuerza del intercambiador El número total y su disponibilidad determinan la capacidad del intercambiador Los de carga negativa adsorben cationes mientras que los de carga positiva adsorben aniones. Así se llaman intercambiadores catiónicos y aniónicos respectivamente.

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12 Cromatografía de intercambio iónico(iex) Mecanismo de separación Separa a moléculas por carga neta. Grupos cargados unidos a la matriz adsorben muestras de carga opuesta(reversible) La desorción se logra a través el cambio del ph o aumentando la concentración de sal del eluyente. Fig 1.1. las moléculas cargadas se absorben en los en los intercambiadores de carga opuesta. La interacción es un equilibrio dinámico que puede estar influenciado por ph como por la concentración de las sales.

13 Adsorción Proteínas poseen aa cargados en su superficie, se adsorben sobre el intercambiador Proteínas con carga neta negativa se absorben a I. catiónicos, La fuerza de adsorción aumenta con el aumento de carga neta. La carga de los aa depende del ph. la carga neta dependerá del ph de una manera que es bastante específica para cada proteína individual. Fig 1.2. El tamaño de la fecha representa la fuerza de la adsorción

14 Desorción Existen 2 posibilidades Reducir la carga neta cambiando el ph. Agregar un ión que compita por las cargas del intercambiador En IEX se utiliza una sal monovalente como NaCl, ya que tiene poco efecto sobre el ph de la corrida. Fig 1.3. A mayor carga neta, mayor es la adsorcion y mayor la concentracion de sales que se necesita para desorber la muestra

15 Separación de proteínas usando gradiente de NaCl 1. El buffer se bombea por la columna hasta que la [salina] y el ph lleguen a un equilibrio 2. La muestra se aplica, se adsorbe y se lava con buffer Elution order: 3. El gradiente comienza y los componentes adsorbidos de la muestra comienzan a eluir en función de su carga neta. 4. Regeneración de los componentes cargados hasta remoción completa.

16 CARGA Los grupos R en las proteínas globulares se encuentran sobre la superficie exterior de la molécula, aunque también pueden tener grupos ocultos o participando de puentes de H Carga depende de las propiedades ácido base de los grupos R

17 Electroforesis Transporte de partículas a través s de un campo eléctrico.

18 ELECTROFORESIS en Papel de filtro o acetato de celulosa Revela la presencia de proteínas con colorantes específicos No existe interacción n con el soporte Resolución muy baja Rápido

19 ELECTROFORESIS EN GELES Separa por CARGA Y TAMAÑO El material soporte interacciona con las proteínas actuando como matriz retardando a las proteínas más m s grandes Geles agarosa Geles poliacrilamidas Condición nativa(page) ) o desnaturalizante(sds-page)

20 Geles poliacrilamida

21 SDS-Page Condiciones desnaturalizante Utiliza en la corrida: β-mercaptoetanol reducidas SDS desnaturalizadas

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23 Las proteinas se separan sólo por su PM El SDS interacciona con las proteínas por interacciones hidrofóbicas cumple 2 funciones críticas: Recubre las proteinas con carga negativa proporcional a su PM Desnaturaliza la estructura nativa de la proteína β -mercaptoetanol rompe los puentes disulfuros

24 Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación n con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

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27 SDS PAGE of Purification 1. Complete mix of proteins 2. High Salt 3. Ion exchange 4. Gel-filtratio 5. Affinity 10micrograms loaded in each lane

28 USOS DETERMINACIÓN N DE PI DETERMINACIÓN DE PM # DE PROTEÍNAS DE UNA MUESTRA # DE SUBUNIDADES de PROTEÍNA

29 Isoelectroenfoque Es un tipo de electroforesis Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de ph. Las moléculas anfotéricas ricas(aa) ) se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de ph. La región n del ánodo es ácida La región n del cátodo c es alcalina. Se establece un gradiente de ph tal que las moléculas que se han de separar tengan su pi dentro del rango.

30 Isoelectroenfoque Las sustancias que estan en regiones de ph < pi tendran carga y migraran hacia el cátodoc Las que se encuentran en medios con ph > pi tendrán n carga - y migrarán n hacia el ánodo La migración n las conducirá a una región n donde el ph coincidirá con su pi neta nula y se detendrán De esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su pi con el ph

31 IEF

32 IEF

33 Electroforesis bidimensional La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según n sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. n. El procedimiento más m s usado se basa en la separación Primera dimensión n mediante ief Segunda dimensión n según n PM mediante electroforesis en poliacrilamida SDS-Page

34 Electroforesis bidimensional

35 Se tiñen los geles se adquieren las imágenes de los geles con un escáner de alta resolución se analizan con un software especializado. Así se pueden comparar geles y observar cambios en el patrón n de manchas: 1. variación n de intensidades, 2. aparición n y/o desaparición n de manchas. La electroforesis 2D, englobada en un estudio de proteómica mica,, va seguida del análisis de manchas concretas hasta llegar a la identificación n de les proteínas correspondientes.

36 Electroforesis 2D Primera dimensión: n: IEF, rango de pi 3-10 Segunda dimensión: n: SDS-PAGE 12%

37 Las aplicaciones de la proteómica Identificación n de nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades Identificación n de nuevos fármacosf Determinación n de mecanismos moleculares involucrados en la patogenia de enfermedades Análisis de rutas de transducción n de señales

38 Cromatografia hidrofóbica Separacion de las proteínas por diferente hidrofobicidad Interaccíon reversible entre la proteína y la superficie hidrofóbica del medio cromatográfico La interaccion con alt fuerza iónicai Desorción: decreciente de [salina]

39 Cromatografia hidrofóbica

40 Cromatografia hidrofóbica Distintos ligandos: fuerza: Eter< isopropil<butil<octil<fenil No se puede predecir el comportamiento de la proteína Kit test

41 Cromatografia hidrofóbica HiTrap HIC Selection Kit -Seleccionar el ligando apropiado y las condiciones experimentales 5 medios con distintas características hidrofóbicas para screening y selección a pequeña escala Phenyl Sepharose High Performance Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (low sub) Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub) Butyl Sepharose 4 Fast Flow Octyl Sepharose 4 Fast Flow

42 Cromatografia hidrofóbica

43 Adsorción En agua pura los efectos hidrofóbicos son muy débiles para causar la interacción de la proteína con el ligando. Ciertas sales aumentan las interacciones hidrofóbicas se pegan al ligando Fig 1.7. HIC deals with the relation between water shells around hydrophobic surfaces, bulk water clustersand salts enhancing hydrophobic interaction. Las siguientes sales aumentan la interacción hidrofóbica: Na2SO4 > K2SO4 > (NH4)2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr > NaSCN

44 Para lograr una desorción selectiva la concentración de sal se disminuye de forma gradual y los componentes eluyen en orden de hidrofobicidad Fig 1.8. The adsorption of hydrophobic molecules is a reversible reaction whose equilibrium is controlled by the salt concentration.

45 Cromatografia hidrofóbica

46 Cromatografía a de afinidad

47 Cromatografía a de afinidad