ELECTROFORESIS Definición

Transcripción

1 ELECTROFORESIS

2 ELECTROFORESIS Definición: Método de análisis basado en la migración diferencial de sustancias en solución cargadas eléctricamente, por efecto de la aplicación de un campo eléctrico.

3 Aplicación n a: a Proteínas en general ADN y ARN Nucleótidos Aminoácidos Polisacáridos Fosfolípidos.

4 CLASIFICACION: a) Según n el soporte: Geles de poliacrilamida Geles de agarosa Tiras de acetato de celulosa Geles de almidón Papel de filtro b) Según n las características de la moléculas a separar: * Carga * Peso molecular (P.M.) * Punto isoeléctrico (p.i) * Combinaciones de las anteriores

5 TEORIA Una partícula cargada eléctricamente con la carga q colocada en un medio determinado y bajo la acción n de un campo eléctrico se verá sometida a dos fuerzas: A) la fuerza de atracción o fuerza propulsora,, llamada fuerza eléctrica (Fe( Fe) B) la fuerza resistente,, llamada resistencia viscosa (Fs( Fs). A) Fuerza eléctrica: (1) Fe = E. q Fe E = ---- = q V E : campo eléctrico V : diferencia de potencial aplicada sobre la longitud ( l ) I q : carga de la partícula

6 B) Resistencia viscosa: : ( 2 ) Fs = 6π π η r v η = viscosidad del medio r = radio de la partícula v = velocidad de la partícula La partícula es empujada por la Fe y su velocidad (v)( aumenta hasta un valor tal que ambas fuerzas se equilibran: E. q = 6π η r v Fe = Fs q Despejando la velocidad tenemos: (3) v = E π η r

7 q q En cambio, el factor depende del medio ( η ) y de la partícula π η r r q Esta relación: ----, se llama Movilidad Electroforética tica 6π η r q y se representa por la letra µ. µ = 6π η r Según (3) la velocidad será: v = E. µ, v = V/l. µ La velocidad de la partícula (v) en una electroforesis es proporcional al campo aplicado (E) y a su Movilidad Electroforética (µ).

8 Electroforesis en tiras de acetato de celulosa Cátodo Siembra Anodo - +

9 Cátodo Siembra Anodo Fuente de Poder (V)

10 Siembra Cátodo Anodo Fuente de Poder (V)

11 Cátodo ++ Siembra +- Anodo Fuente de Poder (V)

12 Cátodo ++ Siembra +- Anodo Fuente de Poder (V)

13 Cátodo ++ Siembra +- Anodo Fuente de Poder (V)

14 Cátodo ++ Siembra +- Anodo Fuente de Poder (V)

15 Carga de aminoácidos en función n del Glicina COOH ph H 3 N + C H H

16 Carga de aminoácidos en función n del Glicina COOH ph COO- H 3 N + C H H 3 N + C H H H pk 1 : 2.34 ph NaOH

17 Carga de aminoácidos en función n del Glicina COOH ph COO- COO- H 3 N + C H H 3 N + C H H 2 N C H H H H pk 1 : 2.34 pk 2 : 9.6 ph NaOH pi: 5.97

18 Ejercicio: Para separar una mezcla de proteínas se realizó una electroforesis con un buffer ph= 4.5. De acuerdo a la siguiente tabla de datos, conteste: Proteína pi a b c d e A. La proteína e migró al cátodo. B. Las proteínas a y d migraron al cátodo. C. La proteína a está más alejada que la e del lugar de siembra. D. La proteína e está más alejada que la a del lugar de siembra.

19 Ejercicio Cuál es el mejor buffer para separar estas cuatro proteínas: Proteína pi a b c d Buffer ph

20 Electroforesis de Proteínas 1) SDS-PAGE 2) Enfoque iso-el eléctrico (Iso-electric focusing) 3)2-D D PAGE (PAGE Bidimensional)

21 SDS - PAGE Geles de poliacrilamida 2β-Mercaptoetanol? El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas envolviendo el esqueleto polipeptídico y les confiere carga negativa.

22 PROCEDIMIENTO 1. Armado del soporte 2. Formación del gel 3. Siembra de la muestra 4. Corrida 5. Fijación y Coloración 6. Desteñido 7. Secado 8. Análisis

23 Siembra - +

24 Determinación n de Pesos Moleculares por SDS-PAGE Banda 1 Banda 2 Muestra St. (PM) Movilidad relativa de una Proteína (Rf). También llamado relación al frente. Rf= Distancia Recorrida por Proteína. Distancia Recorrida por Colorante Azul de Bromofenol PM Curva de Calibración de proteínas por SDS- PAGE al 12 % y = x R 2 = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 Rf (cm) B1=5.43 cm B2=5.55 cm D.R.Col = 9.4 cm. Calcular el Rf y el PM para cada muestra.

25 Electroforesis de Proteínas 1) SDS-PAGE 2) Enfoque iso-el eléctrico (Iso-electric focusing) 3)2-D D PAGE (PAGE Bidimensional)

26 Dos corridas: 1) Enfoque de anfolitos, gradiente de ph. 2) Enfoque de proteínas. Enfoque iso-el eléctrico (Iso-electric focusing) NaOH ph 10 3 H 3 PO 4

27 Electroforesis de Proteínas 1) SDS-PAGE 2) Enfoque iso-el eléctrico (Iso-electric focusing) 3)2-D D PAGE (PAGE Bidimensional)

28 2-D PAGE (PAGE Bidimensional) Electroenfoque (Separación por pi) SDS-PAGE (Separación por Peso Molecular)

29 ELECTROFORESIS Uso en la profesión veterinaria, fundamentalmente en la separación e identificación de sustancias de componentes biológicos, especialmente líquidos como: suero, orina, líquido cefaloraquídeo, líquido de punciones, leche, etc.

30 Análisis de proteínas lácteas l por electroforesis Las proteínas de la leche se dividen en dos grupos: A) Caseínas son las que precipitan a ph 4.6 a 20ºC. Están compuestas por las fracciones αs1, αs2, β y κ; corresponden al 80 % del total de proteínas lácteas. B) Proteínas del suero: α-lactalbúmina y β-lactoglobulina. Las caseínas son muy importantes por su valor nutritivo y también por su influencia sobre los derivados lácteos. Hay alta correlación entre contenido de caseínas y rendimiento quesero; también influyen sobre características tales como el sabor, textura, etc. Objetivo 1: Separar e identificar las fracciones de caseínas bovinas y caprinas por SDS-PAGE.

31 Resultados

32 SDS-PAGE Caseínas Bovinas Caseínas Caprinas St. St. St. St. M M M αs 2 αs 1 β κ C.B. C.B. C.B.S. β-cn C.B.: Muestras individuales bovinas C.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma) β-cn.: St. de beta-caseína (Sigma). C.B.S. C.S. C.T. αs 2 αs 1 y β C.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma) C.S.: St. de Caseína Caprina (Sigma). C.T.: Muestra de Caseína Caprina de la raza Toggenburg. κ

33 Objetivo 2: Estudiar la actividad proteolítica de la enzima Pepsina porcina sobre la B.S.A. (Albúmina Sérica Bovina)

34 Resultado Tiempo en minutos en degradación de BSA por Pepsina porcina. BSA (min) St St. Pocillos: 1: St (PM): 14.3, 18.4, 24, 34.7, 45, 66 KD. 2: (BSA) a tiempo 0 con Pepsina. 3: Idem 2 pero a t: 10 minutos. 4: a 20 min. 5: a 30 min. 6: a 45 min 7: a 60 min. 8: St igual que en pocillo 1 P:

35 Hemoglobina Hemoglobina (PM=64500): formada por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas α (141 aa) y dos cadenas β (146 aa).cada subunidad tiene un grupo Hemo con un átomo de Hierro en estado ferroso (Fe 2 +) que son los que convierten a la Hb en una proteína cromogénica. Objetivo 3: Evaluar el comportamiento de la Hemoglobina corrida por SDS-PAGE, bajo condiciones desnaturalizantes.

36 Resultados

37 SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb) PM aprox. SDS-PAGE (12%) Tinción con Azul de Coomasie Hb (BSA) SUERO

38 SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb) PM aprox. SDS-PAGE (12%) Tinción con Azul de Coomasie SDS-PAGE (15%) Sin tinción PM aprox Hb (BSA) SUERO Hb en diferentes concentraciones

39 Ejercicios 1) Se realiza una electroforesis en un buffer ph 7.6, de una mezcla de tres proteínas (a, b y c) cuyos pi son: pi (a) = 4.3 pi (b) = 5.6 pi (c) = 8.3 De acuerdo con estos datos: A) las proteínas (a) y (b) migrarán al ánodo. B) las proteínas (b) y (c) migrarán al ánodo. C) las proteínas (a) y (b) migrarán al cátodo. D) la proteína (b) migrará al cátodo.

40 2) Se desea separar por electroforesis una mezcla de tres proteínas (I, II, y III) utilizando un buffer ph 5.2 Teniendo en cuenta los siguientes datos: pi P.M. I II III Puede predecirse que: A) la proteína I se dirigirá al ánodo, y las proteínas II y III al cátodo. B) II estará más alejada que I del lugar de siembra. C) III estará más cerca del ánodo que I y II. D) I estará más alejada que II del lugar de siembra.

41 3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas. PROTEINAS PM pi Albúmina α1-globulina α2-globulina β-globulina γ-globulina ph 2 ph 9

42 3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas. PROTEINAS PM pi Albúmina α1-globulina α2-globulina β-globulina γ-globulina ph 2 ph 9 Electroenfoque SDS-PAGE

43 4) La figura adjunta muestra un gel SDS-PAGE. Las proteínas han sido teñidas con azul de coomassie. Se han aplicado 5 muestras distintas: 1,2 y 3.) Proceso de Purificación. 4.) Proteína Purificada 5.) El material purificado (banda C) con tres marcadores de peso molecular A, B y D. St. P.M. A B D D P.M. Curva de calibración de estándares de P.M. por SDS-PAGE. y = x R 2 = 0, A B D 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Rf Cuál es el peso molecular de la proteína pura?

44 5) La protein-kinasa dependiente de camp de mamíferos muestra un peso molecular en condiciones nativas de En SDS-PAGE esta proteína da lugar a una banda de y otra de Cómo se explican estos resultados?